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山水88

木虫 (正式写手)

[求助] Red重组老是不成功,求救

用Red重组敲除基因,做了一个多月了,还是没有成功,前期是抗性基因片段PCR量低,后来换了酶解决了,转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段,过程应该都是比较常规的了,可是这么久就是不成功,请问有做过的指点一下,谢谢了,浪费不起时间了
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mess10

金虫 (小有名气)

引用回帖:
46楼: Originally posted by 山水88 at 2015-10-12 21:30:46
pKD46是重组蛋白质粒,pKD13是抗性基因打靶质粒,两个都要用的呀,阿拉伯糖后面我们都用30mM足够了...

楼主你好,我的重组也遇阻了,现在我把我的实验步骤写出来再次麻烦你根据你的经验给我看看那些需要改进的:
1、将含有PKD46质粒的大肠杆菌按1:100转接至新鲜含有amp的培养基中,培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度10mM,继续培养到OD0.6时,制备电转感受态细胞,dd水洗两次,10%甘油洗一次,10%甘油保存。
2、将目的片段(阿泊拉霉素抗性)>100ng左右(同源臂50bp),2300V电转至感受态中,加入1mlsoc 30度复苏培养1h后,涂布于阿泊拉霉素抗性的LB平板,30度过夜培养.
我来为金币而来!!
48楼2015-10-14 11:07:49
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士,副教授

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因,上面是我发的帖子,混总了一下相关问题,你可以参考一下,如果有问题,欢迎交流。
内生菌资源和核酸分子的利用
2楼2013-11-01 20:29:45
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山水88

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因,上面是我发的帖子,混总了一下相关问题,你可以参考一下,如果有问题,欢迎交流。

你好,看过您的帖子了,对您的工作表示惊喜。我目前的情况是抗性基因PCR片段量应该够了,感受态也是按照文献方法做的,菌株就是常用的BW25113,引物设计50+20bp,转化后在抗性平板上长的挺多的,但全是假阳性,因此想请教一下有什么需要注意或者可能会影响重组效率的步骤,谢谢!
3楼2013-11-01 21:09:04
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山水88

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因,上面是我发的帖子,混总了一下相关问题,你可以参考一下,如果有问题,欢迎交流。

还有一个就是,我想敲除的是三个串联基因,大小在2.5kb,应该说也不是很大了,不知道这个会有影响么。另外一个就是我使用的是四环素抗性基因片段,以前这个抗生素也没用过,所以对它的使用注意事项也不是很清楚,如果是抗性失效的话,长出假阳性也就可以理解了,但同时我做DH5a对照是没有菌落长出来的,因此重组效率不高应该是主要问题了,当然,四环素使用注意事项也烦请老师指点一二,谢谢!
4楼2013-11-01 21:17:33
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