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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-19 11:40:07
wtLAC promoter得话全程用LB培养基，Plac是Crp激活，LacI抑制，Crp是受cAMP（葡萄糖抑制）调控
另外用Plac是没什么道理的，这个promoter不是个很好地promoter（乱起八糟调控太多，strength和leaky都不明，我觉得相 ...

恩，那我可以尝试下pKD46了，看看效果如何
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31楼2013-11-19 15:36:22
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爱久见人心93

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by oaixlittle at 2013-11-02 15:25:13
以前我们做这个转化效率不高，就是增加感受态和PCR片段的量，50ml菌体做一管感受态，PCR产物50或100ul沉淀到5ul直接全部转掉
假阳性多可能是你PCR的模板没弄好，一定不能有质粒混在里面。我们用的是pIJ773，一定要 ...

PCR产物怎样沉淀呢？是用醋酸钠、无水乙醇等浓缩吗？那在浓缩之前是不是要对PCR产物先电泳检测一下呢
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32楼2014-02-22 19:11:32
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by 爱久见人心93 at 2014-02-22 19:11:32
PCR产物怎样沉淀呢？是用醋酸钠、无水乙醇等浓缩吗？那在浓缩之前是不是要对PCR产物先电泳检测一下呢...

有核酸共沉剂试剂盒，PCR完了之后胶回收再核酸共沉
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33楼2014-02-24 10:13:12
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苏菲阿酱

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by oaixlittle at 2013-11-02 15:25:13
以前我们做这个转化效率不高，就是增加感受态和PCR片段的量，50ml菌体做一管感受态，PCR产物50或100ul沉淀到5ul直接全部转掉
假阳性多可能是你PCR的模板没弄好，一定不能有质粒混在里面。我们用的是pIJ773，一定要 ...

你好呀~我们也在做，也是想想你这样增大感受态的用量，但是好像很浓很浓，最后复苏的时候拿起来管底都有沉淀，我想问一下你们最后涂板是离心了之后全部涂板还是只取一部分液体涂板啊，另外能涨多少个阳性克隆啊转化效率有多高？谢谢啦感激不尽！
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34楼2014-10-02 17:02:23
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by 苏菲阿酱 at 2014-10-02 17:02:23
你好呀~我们也在做，也是想想你这样增大感受态的用量，但是好像很浓很浓，最后复苏的时候拿起来管底都有沉淀，我想问一下你们最后涂板是离心了之后全部涂板还是只取一部分液体涂板啊，另外能涨多少个阳性克隆啊转化 ...

全部涂板，效率不是很高
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35楼2014-10-05 08:49:31
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苏菲阿酱

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 山水88 at 2014-10-05 08:49:31
全部涂板，效率不是很高...

哦哦好的谢谢~那大概可以长多少个阳性克隆呢
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36楼2014-10-06 20:00:30
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
36楼: Originally posted by 苏菲阿酱 at 2014-10-06 20:00:30
哦哦好的谢谢~那大概可以长多少个阳性克隆呢...

这个我没计算，当时是挑的挺多的
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37楼2014-10-07 09:00:08
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oaixlittle

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
34楼: Originally posted by 苏菲阿酱 at 2014-10-02 17:02:23
你好呀~我们也在做，也是想想你这样增大感受态的用量，但是好像很浓很浓，最后复苏的时候拿起来管底都有沉淀，我想问一下你们最后涂板是离心了之后全部涂板还是只取一部分液体涂板啊，另外能涨多少个阳性克隆啊转化 ...

全部涂板，效率不高，多的时候二三十个，少的时候几个，而且容易长小的假阳性菌落，转接的时候挑长得大的
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38楼2014-10-10 17:46:59
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llp1030

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 山水88 at 2013-11-02 00:05:54
1、将PKD46化转到大肠杆菌中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：50转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度0.2%,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞 ...

您好！我想问问您敲掉了吗？我最近也是一直在做，可是一直敲不掉，想问问方法上有什么注意的？
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39楼2014-12-29 13:16:41
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
39楼: Originally posted by llp1030 at 2014-12-29 13:16:41
您好！我想问问您敲掉了吗？我最近也是一直在做，可是一直敲不掉，想问问方法上有什么注意的？...

我也不知道你出现了什么问题，反正按照操作来都会做出来的，如果不成功想办法找下原因解决了就行了
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40楼2014-12-30 10:04:29
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