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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Red重组老是不成功，求救
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learningying

铁杆木虫 (著名写手)
您好 我现在在做的同源重组敲出一种细胞壁很厚的菌，这与red重组有什么区别吗？这个真不好敲除啊，请问您现在敲除成功了吗？交流下。。。
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加油，天道酬勤
11楼2013-11-02 14:56:48
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-02 14:28:36
你要做电转+不诱导，这样才能保证没有质粒污染。
还有一点，你目标基因是啥。。  不是housekeeping或者有很高选择压力的吧。。   另外你确定假阳性方法是什么？  目标菌里面能不能P出TetR

目标基因是PTS，这个敲除很常见了。最后用菌落PCR鉴定结果的，引物是同源臂上下各500bp处的，假阳性菌里不能p出TetR
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12楼2013-11-02 15:21:43
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oaixlittle

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
山水88: 金币+5 2013-11-03 17:43:41
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-11-04 08:35:56
以前我们做这个转化效率不高，就是增加感受态和PCR片段的量，50ml菌体做一管感受态，PCR产物50或100ul沉淀到5ul直接全部转掉
假阳性多可能是你PCR的模板没弄好，一定不能有质粒混在里面。我们用的是pIJ773，一定要确保完全酶切，片段电泳后胶回收，处理成线性片段再去做模板
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13楼2013-11-02 15:25:13
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by oaixlittle at 2013-11-02 15:25:13
以前我们做这个转化效率不高，就是增加感受态和PCR片段的量，50ml菌体做一管感受态，PCR产物50或100ul沉淀到5ul直接全部转掉
假阳性多可能是你PCR的模板没弄好，一定不能有质粒混在里面。我们用的是pIJ773，一定要 ...

假阳性里没有发现模板质粒哎，你的意思是要把模板质粒切成线性的再做模板？这样有什么好处呢或者说为什么要这么做呢
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14楼2013-11-02 16:08:19
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by learningying at 2013-11-02 14:56:48
您好 我现在在做的同源重组敲出一种细胞壁很厚的菌，这与red重组有什么区别吗？这个真不好敲除啊，请问您现在敲除成功了吗？交流下。。。

没有呢，一头雾，等成功了交流
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15楼2013-11-02 16:08:49
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
上面同样重组说的是用本身RecA之类的重组吧，那个要求比red系统高不少。

另外lz你目标菌里面既然P不出tetR，那么只能是抗性失效/污染/奇怪的抗性。 反正我觉得既然有不带抗性的假阳性，最好就是换一种抗性。
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16楼2013-11-02 22:53:02
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-02 22:53:02
上面同样重组说的是用本身RecA之类的重组吧，那个要求比red系统高不少。

另外lz你目标菌里面既然P不出tetR，那么只能是抗性失效/污染/奇怪的抗性。 反正我觉得既然有不带抗性的假阳性，最好就是换一种抗性。

谢谢你，我再把你所说的重新验证一下
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17楼2013-11-02 23:21:15
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士，副教授

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
山水88: 金币+10 2013-11-03 17:44:04
引用回帖:
6楼: Originally posted by 山水88 at 2013-11-01 04:05:54
1、将PKD46化转到大肠杆菌中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：50转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入阿拉伯糖至终浓度0.2%,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞 ...

这是我能想到的解决办法：我看你做的实验，不应该是抗生素失效的问题，不过四环素抗性确实不好用，你可以给朱老师索要其他抗性质粒做个对照试试，也许就做出来了。同时我建议你检查所用的所有的实验材料，重组质粒，包括菌株是否正确，我做重组时，都是一个一个材料核实，确保重组系统没有问题，有些问题是当时我自己都没有料想到的，觉得不应该出现的问题，但是就是出错了，（比如曾经碰到重组质粒出错，抗生素失效，而这些都是问题的关键）。总之，重组碰到的问题太多，细心才能解决所有的问题。
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内生菌资源和核酸分子的利用
18楼2013-11-03 01:02:17
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-03 01:02:17
这是我能想到的解决办法：我看你做的实验，不应该是抗生素失效的问题，不过四环素抗性确实不好用，你可以给朱老师索要其他抗性质粒做个对照试试，也许就做出来了。同时我建议你检查所用的所有的实验材料，重组质粒 ...

嗯，谢谢，我再耐着性子仔细检查一遍

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19楼2013-11-03 09:27:17
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山水88

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-11-02 22:53:02
上面同样重组说的是用本身RecA之类的重组吧，那个要求比red系统高不少。

另外lz你目标菌里面既然P不出tetR，那么只能是抗性失效/污染/奇怪的抗性。 反正我觉得既然有不带抗性的假阳性，最好就是换一种抗性。

你好，我又重新做了，从出发菌中没P出来Tet，而假阳性菌中P出来了，同时又做了敲除序列中间部分的PCR，结果都得出了对应序列，用同源臂上下各500bp处引物进行菌落PCR鉴定结果也是一样的，那现在会是什么一个情况呢，应该说不会是其它杂菌吧，可是Tet又重组到哪里去了呢
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20楼2013-11-03 16:23:53
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