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山水88

木虫 (正式写手)

[求助] Red重组老是不成功,求救

用Red重组敲除基因,做了一个多月了,还是没有成功,前期是抗性基因片段PCR量低,后来换了酶解决了,转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段,过程应该都是比较常规的了,可是这么久就是不成功,请问有做过的指点一下,谢谢了,浪费不起时间了
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oaixlittle

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
山水88: 金币+5 2013-11-03 17:43:41
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-11-04 08:35:56
以前我们做这个转化效率不高,就是增加感受态和PCR片段的量,50ml菌体做一管感受态,PCR产物50或100ul沉淀到5ul直接全部转掉
假阳性多可能是你PCR的模板没弄好,一定不能有质粒混在里面。我们用的是pIJ773,一定要确保完全酶切,片段电泳后胶回收,处理成线性片段再去做模板
13楼2013-11-02 15:25:13
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guohuayin

木虫 (著名写手)

博士,副教授

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因,上面是我发的帖子,混总了一下相关问题,你可以参考一下,如果有问题,欢迎交流。
内生菌资源和核酸分子的利用
2楼2013-11-01 20:29:45
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山水88

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因,上面是我发的帖子,混总了一下相关问题,你可以参考一下,如果有问题,欢迎交流。

你好,看过您的帖子了,对您的工作表示惊喜。我目前的情况是抗性基因PCR片段量应该够了,感受态也是按照文献方法做的,菌株就是常用的BW25113,引物设计50+20bp,转化后在抗性平板上长的挺多的,但全是假阳性,因此想请教一下有什么需要注意或者可能会影响重组效率的步骤,谢谢!
3楼2013-11-01 21:09:04
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山水88

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guohuayin at 2013-11-01 20:29:45
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582
我做过Red重组敲除大肠杆菌基因,上面是我发的帖子,混总了一下相关问题,你可以参考一下,如果有问题,欢迎交流。

还有一个就是,我想敲除的是三个串联基因,大小在2.5kb,应该说也不是很大了,不知道这个会有影响么。另外一个就是我使用的是四环素抗性基因片段,以前这个抗生素也没用过,所以对它的使用注意事项也不是很清楚,如果是抗性失效的话,长出假阳性也就可以理解了,但同时我做DH5a对照是没有菌落长出来的,因此重组效率不高应该是主要问题了,当然,四环素使用注意事项也烦请老师指点一二,谢谢!
4楼2013-11-01 21:17:33
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