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山水88木虫 (正式写手)
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Red重组老是不成功，求救
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| 用Red重组敲除基因，做了一个多月了，还是没有成功，前期是抗性基因片段PCR量低，后来换了酶解决了，转了pKD46之后的菌株诱导表达到OD0.6制备感受态转化PCR片段，过程应该都是比较常规的了，可是这么久就是不成功，请问有做过的指点一下，谢谢了，浪费不起时间了 |
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山水88
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你好，昨天先酶切后PCR的假阳性菌中还是有模板质粒的出现（随机挑了四个，一个非常明显有模板质粒），那就不知道其它几株菌没有质粒怎么会有Tet抗性呢？ 下面是我的步骤（文献中所述方法）： 1）电转化重组质粒（SpeR抗性，IPTG诱导）进入所要敲除基因的菌株BW25113中，涂平板筛选其SpeR抗性菌落 2）将活化好的阳性菌落转接至SOB培养基（添加0.5%葡萄糖、100μg/mL SpeR及2mM IPTG）培养至OD600=0.6制备感受态 3）双酶切抗性质粒，以其线性片段为模板扩增TetR基因，胶回收纯化并核酸共沉 4）将PCR产物电转入所制感受态中，添加1mL SOB培养基中复苏至少2h，取500μL涂布LB平板（添加0.5%葡萄糖、100μg/mL SpeR及10μg/mL TetR），30℃过夜培养后挑取菌落进行PCR验证。剩余500μL复苏至次日再涂布挑菌验证。 由于重组质粒后面要继续使用，所以一直保证它的存在，然后由于Mg2+对TetR的影响，我使用的是LB培养基而没有用SOB，谢谢！ |
26楼2013-11-19 09:48:51
guohuayin
木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-11-04 08:36:13
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http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6366582 我做过Red重组敲除大肠杆菌基因，上面是我发的帖子，混总了一下相关问题，你可以参考一下，如果有问题，欢迎交流。 |
2楼2013-11-01 20:29:45
山水88
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3楼2013-11-01 21:09:04
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4楼2013-11-01 21:17:33