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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 酵母基因敲除，PCR验证遇到的问题。
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三蛰

铜虫 (小有名气)

[求助] 酵母基因敲除，PCR验证遇到的问题。 已有4人参与

这是我的PCR验证酵母基因敲除（方法就是常用的同源重组法，醋酸锂转化）泳道1出现的是从pUG6扩增disruption cassette 的一对引物，2-5泳道是A-B，6-9泳道是C-D，10-13泳道是A-D，（其中A、D是目的基因两侧的引物，B、C是目的基因内部的引物，B-M、C-M是marker内部的引物）不过，A、B-M和C-M、D并没有条带，所有样品都是用酵母菌液（冻融处理）作为模版。
我的问题是，我的A-D条带大小说明目的基因还在，且A-B，C-D的条带也说明了这点，但是为什么我的泳道1还有大小与我的disruption cassette 相同的条带呢？而且我今天做了个disruptionF，B-M和C-M，disruptionR两对引物，都有大小与预期相同的条带。说明disruption cassette 已经在酵母细胞中了。。。没有发生同源重组？
各位分析一下什么情况……
酵母基因敲除，PCR验证遇到的问题。
yeast2 编辑.jpg
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我不会！
1楼 2014-01-07 20:45:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小晖晖在复旦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2014-02-26 22:23:49
我也是遇到同样的问题，转化后的酵母在抗性板上张得很欢快，可是PCR验证就是不对，我判断是发生了非同源交换，情况和你的很像。
不知道你现在情况如何了？我现在是想多做几次看看能不能成，我的同源部分各有700BP， ...

我现在也遇到你的这个问题，同源部分现在是300，也不成功，你的问题解决了么？跪求指导啊
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16楼2014-12-24 13:46:46
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普通回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)
不要沉掉……………………
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我不会！
2楼2014-01-07 23:17:40
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三蛰

铜虫 (小有名气)
不要沉掉……千万！有做过的望不吝赐教。。。
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我不会！
3楼2014-01-08 09:52:09
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spirit87

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-10 23:23:21
三蛰: 金币+2, ★有帮助 2014-01-12 21:47:39
你想过没有酵母也会存在二倍体的问题，如果只敲出了一份基因，而另外一份存在的话就这样。我们经常遇到类似情况
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4楼2014-01-10 19:57:57
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by spirit87 at 2014-01-10 19:57:57
你想过没有酵母也会存在二倍体的问题，如果只敲出了一份基因，而另外一份存在的话就这样。我们经常遇到类似情况

嗯，是常用的实验室工程酵母BY4741是单倍体
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我不会！
5楼2014-01-12 21:47:31
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meimei23

金虫 (著名写手)
请问楼主问题解决了吗？我做细菌的敲除，也遇到和你一样的情况，敲除臂能扩到，同时内部检测引物也能扩到！
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从事分子生物学的研究
6楼2014-01-15 10:33:55
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by meimei23 at 2014-01-15 10:33:55
请问楼主问题解决了吗？我做细菌的敲除，也遇到和你一样的情况，敲除臂能扩到，同时内部检测引物也能扩到！

么有搞定呀，我们初步判断是敲除掉其他基因了，而非目的基因。只能重新设计敲除组件了，我的小心脏啊…………
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我不会！
7楼2014-01-15 14:35:49
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meimei23

金虫 (著名写手)
怎么会敲除其他基因呢，同源臂设置的不是特异性的吗！
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从事分子生物学的研究
8楼2014-01-15 17:15:36
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by meimei23 at 2014-01-15 17:15:36
怎么会敲除其他基因呢，同源臂设置的不是特异性的吗！

问题就出在这里呀，万一同源臂特异性不强，，，，
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我不会！
9楼2014-01-15 19:19:13
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
三蛰(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-03-02 10:58:33
我也是遇到同样的问题，转化后的酵母在抗性板上张得很欢快，可是PCR验证就是不对，我判断是发生了非同源交换，情况和你的很像。
不知道你现在情况如何了？我现在是想多做几次看看能不能成，我的同源部分各有700BP，我觉得发生非同源的概率太不可思议了，文献中的报道都是差不多的做法……感觉做起来特别无力……共勉吧……希望你成功（PS。我现在想再扩大同源的部分，不知道能不能成。）
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10楼2014-02-26 22:23:49
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