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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电转后PCR验证问题
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yakamoz294

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母电转后PCR验证问题 已有1人参与

我的目的基因片段长度为2781，连接到9K载体上，电转后从MD平板上挑取菌落提取基因组用5AOX和3AOX引物进行验证。之前就出现过这种情况，只能P出2200kb的片段，p不出目的基因片段，后来换了一种预混的taq酶就好了，但是现在又不行了，又是p不出目的基因了，怎么办，可不可以通过调整PCR条件来改善呢
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1楼 2013-12-08 09:20:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR是否做了阳性对照？用于PCR的基因组模板是否定量？
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2楼2013-12-08 17:07:31
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-08 18:55:31
酵母的菌落PCR比较难做，主要是在酵母的细胞壁比大肠杆菌的厚，不容易被煮开，我一般是这么做的
1. 挑取酵母菌落，稀释在水中，然后放PCR仪，100度煮12min
2. 离心取上清，做PCR

你可以试一下，祝好运！
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-12-08 17:35:39
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lymic07

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-08 18:55:39
本帖内容被屏蔽
4楼2013-12-08 18:06:14
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yakamoz294

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lymic07 at 2013-12-08 18:06:14
楼主的情况正好跟我相反，我最近也在做酵母基因组的PCR，我的目的基因700bp左右，用普通的pfu不好P处目的条带来，还有基因组本身的2.2kb的条带，后来我用的预混的taq酶，能够P出目的条带，而且5μl点样电泳，条带很 ...

谢谢哦，可是怎么送你金币呀
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5楼2013-12-12 18:47:18
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风云1

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-08 17:35:39
酵母的菌落PCR比较难做，主要是在酵母的细胞壁比大肠杆菌的厚，不容易被煮开，我一般是这么做的
1. 挑取酵母菌落，稀释在水中，然后放PCR仪，100度煮12min
2. 离心取上清，做PCR

你可以试一下，祝好运！

我是煮 冻煮的方式做的模板，5AOX和3AOX做引物也P不出来啊
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6楼2016-03-14 15:32:12
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wang2568

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

普通的taq比pfu扩增效率高，但是酵母壁比较厚，可以试着增加培养时间或者做破壁处理

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2016-03-14 17:18:43
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