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yakamoz294

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母电转后PCR验证问题 已有1人参与

我的目的基因片段长度为2781,连接到9K载体上,电转后从MD平板上挑取菌落提取基因组用5AOX和3AOX引物进行验证。之前就出现过这种情况,只能P出2200kb的片段,p不出目的基因片段,后来换了一种预混的taq酶就好了,但是现在又不行了,又是p不出目的基因了,怎么办,可不可以通过调整PCR条件来改善呢
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR是否做了阳性对照?用于PCR的基因组模板是否定量?
2楼2013-12-08 17:07:31
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-08 18:55:31
酵母的菌落PCR比较难做,主要是在酵母的细胞壁比大肠杆菌的厚,不容易被煮开,我一般是这么做的
1. 挑取酵母菌落,稀释在水中,然后放PCR仪,100度煮12min
2. 离心取上清,做PCR

你可以试一下,祝好运!
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-12-08 17:35:39
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lymic07

禁虫 (初入文坛)

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-08 18:55:39
本帖内容被屏蔽

4楼2013-12-08 18:06:14
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yakamoz294

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lymic07 at 2013-12-08 18:06:14
楼主的情况正好跟我相反,我最近也在做酵母基因组的PCR,我的目的基因700bp左右,用普通的pfu不好P处目的条带来,还有基因组本身的2.2kb的条带,后来我用的预混的taq酶,能够P出目的条带,而且5μl点样电泳,条带很 ...

谢谢哦,可是怎么送你金币呀
5楼2013-12-12 18:47:18
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风云1

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-08 17:35:39
酵母的菌落PCR比较难做,主要是在酵母的细胞壁比大肠杆菌的厚,不容易被煮开,我一般是这么做的
1. 挑取酵母菌落,稀释在水中,然后放PCR仪,100度煮12min
2. 离心取上清,做PCR

你可以试一下,祝好运!

我是煮 冻煮的方式做的模板,5AOX和3AOX做引物也P不出来啊
6楼2016-03-14 15:32:12
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wang2568

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

普通的taq比pfu扩增效率高,但是酵母壁比较厚,可以试着增加培养时间或者做破壁处理

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
7楼2016-03-14 17:18:43
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