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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 关于酵母抗zeocin时间问题
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lyani

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于酵母抗zeocin时间问题

GS115本身是没有zeocin抗性的。
但是为了确保万无一失，我将GS115挑单菌落，30°C 摇16h，菌液在OD600为0.3左右，涂200ul于 YPD+zeocin（博来霉素终浓度为100ug/ml）上，30°C避光培养，但是72个小时就长了很小的菌落。是zeocin失效了，还是什么其他问题？还是我在涂板的时候就应该避光操作？
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1楼 2012-04-16 10:25:42
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回帖置顶 ( 共有1个 )

元雪浈

银虫 (初入文坛)
★
lyani(金币+1): 谢谢参与
遇到和楼主相似的问题，我是将大肠杆菌划线与含zeocin的LB平板的，24小时不长，但是，36小时就长出来了很微小的菌落，是zecin长时间失效了么？我要挑选的是用于做电转化实验用的，在zeoxin上不长的菌，这可怎么挑 啊
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4楼2012-09-08 10:13:33
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普通回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)
★
lyani(金币+1): 谢谢参与
涂板没必要避光操作，我以前都是用25-50ug/ml  可能菌体太浓的原因吧 也可能Z失效   直接挑单菌落画板看会不会长~
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2楼2012-04-16 10:32:33
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lyani

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-04-16 10:32:33:
涂板没必要避光操作，我以前都是用25-50ug/ml  可能菌体太浓的原因吧 也可能Z失效   直接挑单菌落画板看会不会长~

谢谢。
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3楼2012-04-16 10:41:33
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啊Q精神

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zeocin不是100%有效的，说明书上应该有说明了有效成分占多少
操作手册上是涂多少？
G418的话是涂10的5次方个细胞到一块板，1OD1ml好像是5乘10的7次方个细胞
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5楼2012-09-09 17:39:30
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reallpf

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
关于Zeocin抗性的使用，一般大肠是100mL培养基加25uL就足够，但是要是LLB，不能使用LB，高盐浓度会降低Zeocin效率。
对于酵母，100mL培养基加40-50uL足矣。
而且Zeocin抗性的筛选效率一般比较低，长得菌落数会少，所以要适当增加转化用的质粒浓度和DNA量，特别是转化酵母。

关于倒Zeocin抗性平板，倒板后吹板时机的避光，培养记得避光。涂板时是不用避光的。

而Zeocin抗性72h肯定还有筛选效率的，不会失效。所以可能是你的Zeocin本来效率就不好，或者GS115污染。

另外倒板加Zeocin抗性的时候，温度非常重要，最好的是手心不烫，手背烫（大约45-50度）。温度高了，抗性会失效的。
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6楼2012-09-09 19:57:27
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一休陈

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-04-16 10:32:33
涂板没必要避光操作，我以前都是用25-50ug/ml  可能菌体太浓的原因吧 也可能Z失效   直接挑单菌落画板看会不会长~

请问你以前是用博来霉素筛选酿酒酵母阳性克隆吗？博来霉素母液保存也是要低温冻存避光保存对吧？一般博来霉素多酿酒酵母阳性克隆的筛选工作浓度为25-50ug/ml?
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7楼2014-02-21 11:04:06
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一休陈

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-09 19:57:27
关于Zeocin抗性的使用，一般大肠是100mL培养基加25uL就足够，但是要是LLB，不能使用LB，高盐浓度会降低Zeocin效率。
对于酵母，100mL培养基加40-50uL足矣。
而且Zeocin抗性的筛选效率一般比较低，长得菌落数会少， ...

请问你的博来霉素的母液浓度是100mg/mL吗？
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8楼2014-02-21 14:26:47
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张94530

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by reallpf at 2012-09-09 19:57:27
关于Zeocin抗性的使用，一般大肠是100mL培养基加25uL就足够，但是要是LLB，不能使用LB，高盐浓度会降低Zeocin效率。
对于酵母，100mL培养基加40-50uL足矣。
而且Zeocin抗性的筛选效率一般比较低，长得菌落数会少， ...

用了LB培养基，zeocin的效率会降低多少呢，浓度为100ug/ml，还能筛选吗?
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9楼2015-08-25 15:24:13
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Mr.四娃

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的加到500ug，ml，长出了全部是杂菌，为什么呢
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10楼2016-03-22 11:06:07
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