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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 表达载体构建的若干问题，谢谢大家。
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henghengyouyou

银虫 (正式写手)

[求助] 表达载体构建的若干问题，谢谢大家。 已有2人参与

PCR产物可以直接连表达载体么？
如题，本人想构建植物过表达载体，再设计引物时候考虑了点问题。请教一下大家。 我看很多人也是通过扩增后连接到中间载体（T 载体或者其他），这样做第一步要测序验证，挑选正确克隆，通过酶切、连接等步骤连接到表达载体上。
1. 如果我用高保真酶将目的片段扩增（引物带有内切酶接头和保护碱基），纯化回收酶切后，是否可以直接连上表达载体？这样是不是效率很低，是不是要求回收产物量很多？我知道连接后肯定要挑多个单克隆测序验证的。是不是连接到中间载体上获得的正确克隆酶切连接会更容易些？
2.带有接头和饱和碱基的PCR扩增产物（NEB，longamp taq）能否连接到T载体上，上面说在扩增后3 END有个a，我觉得应该可以？
3.在载体上的酶切位点选择时候，是必须选择相隔较远的酶site么？挨着肯定不行？？？一个酶切了后，另一个内切酶结合不上去？
4. 载体上有的内切酶没并不是粘性末端，平末端也可以用于连接表达载体么？
5.我将ORF连接到PBI121上时候，是否需要考虑移码问题，我的意思是直接在ORF前，TAA后直接加入内切酶的识别序列和保护碱基就行？
6. 我只是想做基因的功能验证，目前没有计划做GUS，在我的目的基因保留TAA的情况下，留着GUS应该没问题吧，没必要吧GUS切掉吧？
7. 我将基因的promoter region 连接到GUS前面，是不是就可以知道该基因的组织表达情况？
8.在构建中间载体时候，比如T载体，如果T载体上面和表达载体上面没有相同可用的内切酶，是不是只能在设计引物时候加入酶切序列和保护碱基了，如果有的话，当然就不用考虑了，直接引物扩增连T，然后连表达载体。
9.我看有文章是将包括promoter+orf+3end的基因组序列直接连入到不含有35s的载体上，这样是不是不需要考虑移码了，直接连接进去就可以了？
问题较多，非常感谢大家。

谢谢各位！
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1楼 2013-05-31 04:05:22
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
henghengyouyou(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-31 10:49:55
henghengyouyou: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-31 13:24:49
一次问2-3个吧，你一下子问这么多谁能回答啊！！！纯化酶切后可以直接连表达载体！目的片段加多点解决连接效率低的问题。扩增后3‘加A的产物，纯化后可以直接连T载体。挨着的酶如果是常用的内切酶，可以双酶切的话，切开是没问题的。最好用粘性末端的酶，链接容易；平末端的酶也能连，效率比较低，连接时间延长至16小时。不用考虑移码问题的，真核表达载体可以识别起始密码子。GUS留着可以做GUS染色，初步筛选转基因阳性植株。组织表达情况，好像不是用这个载体，用它的同类载体PBI101应该更好。第8你说的正确。promoter+orf+3end这样构建到表达载体上更好，表达情况更准确。
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2楼2013-05-31 08:53:33
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henghengyouyou

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-05-31 08:53:33
一次问2-3个吧，你一下子问这么多谁能回答啊！！！纯化酶切后可以直接连表达载体！目的片段加多点解决连接效率低的问题。扩增后3‘加A的产物，纯化后可以直接连T载体。挨着的酶如果是常用的内切酶，可以双酶切的话， ...

但是留着GUS的话，产生融合蛋白会不会影响目的蛋白的功能？
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3楼2013-05-31 13:27:36
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sxr1268

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by henghengyouyou at 2013-05-31 13:27:36
但是留着GUS的话，产生融合蛋白会不会影响目的蛋白的功能？...

请问有表达载体测序不成功的问题么
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4楼2014-03-13 15:23:12
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我也做这个过表达载体的构建，我看到你想用纯化产物直接连载体，我有一个问题，就是你已经测序了吗？如果有，序列可以分析，酶切位点的分析就绝对没有问题，但是如果你没有测序，万一你的序列上有一个碱基的差异造成酶切位点可能切割你的目的基因怎么办？
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5楼2014-11-05 11:09:55
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龚小亮

新虫 (小有名气)
您第6个问题：我只是想做基因的功能验证，目前没有计划做GUS，在我的目的基因保留TAA的情况下，留着GUS应该没问题吧，没必要吧GUS切掉吧？   
不知道您现在这个问题已经弄清楚了吗？  我构建载体的时候，刚好出现了这样的情况，也用的是pbi121，用双酶切后目的基因保留有TAG，GUS保留，也只是功能验证，不知道这样是否可行？
您的第9个问题：我看有文章是将包括promoter+orf+3end的基因组序列直接连入到不含有35s的载体上，这样是不是不需要考虑移码了，直接连接进去就可以了？
后面你真正构建载体是用的这个方法吗？
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6楼2015-10-22 20:33:41
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