| 查看: 2433 | 回复: 5 | ||
henghengyouyou银虫 (正式写手)
|
[求助]
表达载体构建的若干问题，谢谢大家。 已有2人参与
|
|
PCR产物可以直接连表达载体么？ 如题，本人想构建植物过表达载体，再设计引物时候考虑了点问题。请教一下大家。 我看很多人也是通过扩增后连接到中间载体（T 载体或者其他），这样做第一步要测序验证，挑选正确克隆，通过酶切、连接等步骤连接到表达载体上。 1. 如果我用高保真酶将目的片段扩增（引物带有内切酶接头和保护碱基），纯化回收酶切后，是否可以直接连上表达载体？这样是不是效率很低，是不是要求回收产物量很多？我知道连接后肯定要挑多个单克隆测序验证的。是不是连接到中间载体上获得的正确克隆酶切连接会更容易些？ 2.带有接头和饱和碱基的PCR扩增产物（NEB，longamp taq）能否连接到T载体上，上面说在扩增后3 END有个a，我觉得应该可以？ 3.在载体上的酶切位点选择时候，是必须选择相隔较远的酶site么？挨着肯定不行？？？一个酶切了后，另一个内切酶结合不上去？ 4. 载体上有的内切酶没并不是粘性末端，平末端也可以用于连接表达载体么？ 5.我将ORF连接到PBI121上时候，是否需要考虑移码问题，我的意思是直接在ORF前，TAA后直接加入内切酶的识别序列和保护碱基就行？ 6. 我只是想做基因的功能验证，目前没有计划做GUS，在我的目的基因保留TAA的情况下，留着GUS应该没问题吧，没必要吧GUS切掉吧？ 7. 我将基因的promoter region 连接到GUS前面，是不是就可以知道该基因的组织表达情况？ 8.在构建中间载体时候，比如T载体，如果T载体上面和表达载体上面没有相同可用的内切酶，是不是只能在设计引物时候加入酶切序列和保护碱基了，如果有的话，当然就不用考虑了，直接引物扩增连T，然后连表达载体。 9.我看有文章是将包括promoter+orf+3end的基因组序列直接连入到不含有35s的载体上，这样是不是不需要考虑移码了，直接连接进去就可以了？ 问题较多，非常感谢大家。 谢谢各位！ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有177人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 目的基因表达载体的构建问题~请指教
已经有6人回复
- 如何进行表达载体构建
已经有25人回复
- 表达载体构建 碱基突变 缺失 原因
已经有23人回复
- 原核表达载体的构建
已经有37人回复
- 构建了个基因的表达载体，发现有一个氨基酸发生突变
已经有10人回复
- 关于基因构建中开放阅读框架的若干问题
已经有7人回复
- 两个基因融合构建真核表达载体需要去掉信号肽吗?
已经有7人回复
- 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
已经有54人回复
- 关于农杆菌单菌株/双质粒表达载体的构建问题
已经有14人回复
- 用过pET28a(+)表达载体的高人请指教
已经有31人回复
- 【求助/交流】表达载体pCAMBIA1304表达顺序看不懂
已经有12人回复
- 关于SiRNA表达载体构建的问题
已经有9人回复
- 表达载体的构建
已经有17人回复
- 表达载体构建的相关问题
已经有15人回复
- 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体
已经有8人回复
- 【求助/交流】关于基因过表达的
已经有4人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】构建载体怎么写文章
已经有11人回复
- 【求助/交流】表达载体构建不成功的原因
已经有27人回复
- 【求助/交流】在构建基因表达载体的时候什么时候需要人为地在上面加上启动子？
已经有6人回复
- 【求助/交流】物过量表达载体可否以基因组DNA进行
已经有6人回复
- 急求：构建载体时引物设计的问题
已经有7人回复
wangqi1107
银虫 (小有名气)
- 应助: 57 (初中生)
- 金币: 192.8
- 红花: 2
- 帖子: 122
- 在线: 121.7小时
- 虫号: 995882
- 注册: 2010-04-13
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
henghengyouyou(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-31 10:49:55
henghengyouyou: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-31 13:24:49
感谢参与，应助指数 +1
henghengyouyou(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-31 10:49:55
henghengyouyou: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-31 13:24:49
| 一次问2-3个吧，你一下子问这么多谁能回答啊！！！纯化酶切后可以直接连表达载体！目的片段加多点解决连接效率低的问题。扩增后3‘加A的产物，纯化后可以直接连T载体。挨着的酶如果是常用的内切酶，可以双酶切的话，切开是没问题的。最好用粘性末端的酶，链接容易；平末端的酶也能连，效率比较低，连接时间延长至16小时。不用考虑移码问题的，真核表达载体可以识别起始密码子。GUS留着可以做GUS染色，初步筛选转基因阳性植株。组织表达情况，好像不是用这个载体，用它的同类载体PBI101应该更好。第8你说的正确。promoter+orf+3end这样构建到表达载体上更好，表达情况更准确。 |
2楼2013-05-31 08:53:33
henghengyouyou
银虫 (正式写手)
- 应助: 29 (小学生)
- 金币: 338.5
- 散金: 238
- 红花: 6
- 帖子: 513
- 在线: 193小时
- 虫号: 462712
- 注册: 2007-11-19
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
3楼2013-05-31 13:27:36
4楼2014-03-13 15:23:12
5楼2014-11-05 11:09:55
6楼2015-10-22 20:33:41
