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henghengyouyou银虫 (正式写手)
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表达载体构建的若干问题，谢谢大家。 已有2人参与
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PCR产物可以直接连表达载体么？ 如题，本人想构建植物过表达载体，再设计引物时候考虑了点问题。请教一下大家。 我看很多人也是通过扩增后连接到中间载体（T 载体或者其他），这样做第一步要测序验证，挑选正确克隆，通过酶切、连接等步骤连接到表达载体上。 1. 如果我用高保真酶将目的片段扩增（引物带有内切酶接头和保护碱基），纯化回收酶切后，是否可以直接连上表达载体？这样是不是效率很低，是不是要求回收产物量很多？我知道连接后肯定要挑多个单克隆测序验证的。是不是连接到中间载体上获得的正确克隆酶切连接会更容易些？ 2.带有接头和饱和碱基的PCR扩增产物（NEB，longamp taq）能否连接到T载体上，上面说在扩增后3 END有个a，我觉得应该可以？ 3.在载体上的酶切位点选择时候，是必须选择相隔较远的酶site么？挨着肯定不行？？？一个酶切了后，另一个内切酶结合不上去？ 4. 载体上有的内切酶没并不是粘性末端，平末端也可以用于连接表达载体么？ 5.我将ORF连接到PBI121上时候，是否需要考虑移码问题，我的意思是直接在ORF前，TAA后直接加入内切酶的识别序列和保护碱基就行？ 6. 我只是想做基因的功能验证，目前没有计划做GUS，在我的目的基因保留TAA的情况下，留着GUS应该没问题吧，没必要吧GUS切掉吧？ 7. 我将基因的promoter region 连接到GUS前面，是不是就可以知道该基因的组织表达情况？ 8.在构建中间载体时候，比如T载体，如果T载体上面和表达载体上面没有相同可用的内切酶，是不是只能在设计引物时候加入酶切序列和保护碱基了，如果有的话，当然就不用考虑了，直接引物扩增连T，然后连表达载体。 9.我看有文章是将包括promoter+orf+3end的基因组序列直接连入到不含有35s的载体上，这样是不是不需要考虑移码了，直接连接进去就可以了？ 问题较多，非常感谢大家。 谢谢各位！ |
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wangqi1107
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| 一次问2-3个吧，你一下子问这么多谁能回答啊！！！纯化酶切后可以直接连表达载体！目的片段加多点解决连接效率低的问题。扩增后3‘加A的产物，纯化后可以直接连T载体。挨着的酶如果是常用的内切酶，可以双酶切的话，切开是没问题的。最好用粘性末端的酶，链接容易；平末端的酶也能连，效率比较低，连接时间延长至16小时。不用考虑移码问题的，真核表达载体可以识别起始密码子。GUS留着可以做GUS染色，初步筛选转基因阳性植株。组织表达情况，好像不是用这个载体，用它的同类载体PBI101应该更好。第8你说的正确。promoter+orf+3end这样构建到表达载体上更好，表达情况更准确。 |
2楼2013-05-31 08:53:33
henghengyouyou
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