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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建 碱基突变 缺失 原因
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芥末猫

银虫 (小有名气)

[求助] 表达载体构建 碱基突变 缺失 原因

最近做表达载体构建，总是出现碱基缺失和突变，而且总有突变成终止密码子的情况，请教各位前辈，这到底是怎么回事啊？？？？ 望不吝赐教
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1楼 2012-11-25 15:44:51
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-11-25 20:33:20
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-11-25 20:33:35
我想细致了解一下，你做克隆的具体过程，需要你提供几个参数
1. 你用的是什么酶？
2. PCR时的循环是多少？
3. 你目标序列的长度是多少？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2012-11-25 20:22:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by gongeleven at 2012-11-26 10:16:34
加A的肯定不是高保真。。。...

我看说明书上写的好像是中混合酶  因为我那个是改良的载体 跟t载体似的，我合计加a正好啊   它跟我之前用的一个酶  我看保真性写的一样的啊
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14楼2012-11-26 10:34:33
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普通回帖

polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-11-25 20:33:17
从你的描述来看,很有可能突变后的序列对E.coli有毒,缺失和突变成终止密码子都是把序列的阅读框改变,以此来保护自己.建议转化后室温生长或者换其它感受细胞试试.
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
2楼2012-11-25 17:51:43
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果是PCR出现突变，就是Taq酶的问题，建议换个高保真的
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
3楼2012-11-25 19:30:43
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by polepolar at 2012-11-25 17:51:43
从你的描述来看,很有可能突变后的序列对E.coli有毒,缺失和突变成终止密码子都是把序列的阅读框改变,以此来保护自己.建议转化后室温生长或者换其它感受细胞试试.

“很有可能突变后的序列对E.coli有毒”，这个是什么意思？？转化后升温生长，是指涂了平板以后，不在37°过夜，在室温培养出单克隆吗？？谢谢
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4楼2012-11-25 19:31:11
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2012-11-25 19:30:43
如果是PCR出现突变，就是Taq酶的问题，建议换个高保真的

你好 我用的是pcr产物回收以后直接连接的表达载体，是不是很有可能是酶的问题啊
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5楼2012-11-25 20:01:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果目的片段不大，用什么酶都应该可以的，但PCR尽量不要采用过高的循环数。如果目的片段较长，建议使用高保真酶。
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7楼2012-11-26 05:48:05
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
突变成终止密码子的概率挺大的……
问题肯定是出在PCR，假如你用的胶回收的话还有可能是紫外照太久了……
要么还是用高保真酶吧，你这出现概率挺大的话说明你的片段不怎么短
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8楼2012-11-26 08:15:36
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-25 20:22:10
我想细致了解一下，你做克隆的具体过程，需要你提供几个参数
1. 你用的是什么酶？
2. PCR时的循环是多少？
3. 你目标序列的长度是多少？

我用的全式金的 trans taq T DNA polymerase，看说明书上说也是高保真酶啊 ，

PCR是35循环
目标序列有的1kb有的2kb
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9楼2012-11-26 08:51:22
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2012-11-25 19:30:43
如果是PCR出现突变，就是Taq酶的问题，建议换个高保真的

我用的酶也是说是高保真的，还加A呢 到底保真性需要到什么程度才可以啊
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10楼2012-11-26 08:52:36
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