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芥末猫

银虫 (小有名气)

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7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-26 05:48:05
如果目的片段不大,用什么酶都应该可以的,但PCR尽量不要采用过高的循环数。如果目的片段较长,建议使用高保真酶。

35个循环 多了??
11楼2012-11-26 08:53:07
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芥末猫

银虫 (小有名气)

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8楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 08:15:36
突变成终止密码子的概率挺大的……
问题肯定是出在PCR,假如你用的胶回收的话还有可能是紫外照太久了……
要么还是用高保真酶吧,你这出现概率挺大的话说明你的片段不怎么短

突变是因为紫外照射?? 控制在多长时间以内会比较安全呢
12楼2012-11-26 08:54:09
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

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10楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:52:36
我用的酶也是说是高保真的,还加A呢 到底保真性需要到什么程度才可以啊...

加A的肯定不是高保真。。。
13楼2012-11-26 10:16:34
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芥末猫

银虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by gongeleven at 2012-11-26 10:16:34
加A的肯定不是高保真。。。...

我看说明书上写的好像是中混合酶  因为我那个是改良的载体 跟t载体似的,我合计加a正好啊   它跟我之前用的一个酶  我看保真性写的一样的啊
14楼2012-11-26 10:34:33
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

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14楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 10:34:33
我看说明书上写的好像是中混合酶  因为我那个是改良的载体 跟t载体似的,我合计加a正好啊   它跟我之前用的一个酶  我看保真性写的一样的啊...

你那个应该是taq+pfu的混合酶,保真能力比pfu差,但要比taq好,纯高保真酶的话是不会加A的,反而会切掉A尾,很多国产公司都在推销这种混合酶,我用过天根的taq plus,很烂,加A效率奇差,还不如pfu扩增自己加A,我估计你是循环太多了,试试28个循环,然后换个高保真酶吧.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
15楼2012-11-26 11:11:13
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

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12楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:54:09
突变是因为紫外照射?? 控制在多长时间以内会比较安全呢...

我的意思是你如果是切胶回收的话,不是得在紫外光照射下回收么……紫外线是有可能导致DNA损伤,然后转化进细胞之后突变的~
没有一个固定的时间,总之在你力所能及的范围内尽快把胶切完应该就没问题的
16楼2012-11-26 12:10:07
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polepolar

银虫 (初入文坛)

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4楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-25 19:31:11
“很有可能突变后的序列对E.coli有毒”,这个是什么意思??转化后升温生长,是指涂了平板以后,不在37°过夜,在室温培养出单克隆吗??谢谢...

“很有可能突变后的序列对E.coli有毒”,这些序列转化后会翻译成对E.coli 生长代谢有影响的蛋白,E.coli出于对自身的保护,不会让该序列正常的翻译,就会出现缺失,终止密码子等。
“转化后升温生长,是指涂了平板以后,不在37°过夜,在室温培养出单克隆吗??”,是的,就是把平板放在室温,大约两天长出克隆。
北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
17楼2012-11-26 12:13:06
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

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9楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:51:22
我用的全式金的 trans taq T DNA polymerase,看说明书上说也是高保真酶啊 ,

PCR是35循环
目标序列有的1kb有的2kb...

问题就出在这里,
1.建议楼走用Pfu, Kod,primestar等高保真酶,不要用混合酶
2. 建议楼主降低循环25个循环足以,加大模板的量,不知道楼上用什么作为模板
3. 楼主产物是连T-载体么?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2012-11-26 18:55:57
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芥末猫

银虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-26 18:55:57
问题就出在这里,
1.建议楼走用Pfu, Kod,primestar等高保真酶,不要用混合酶
2. 建议楼主降低循环25个循环足以,加大模板的量,不知道楼上用什么作为模板
3. 楼主产物是连T-载体么?...

你好,你说的这几个酶是什么公司的啊
自己反转录的cDNA作为模板

载体是改良过的,相当于连t载体
19楼2012-11-26 22:09:32
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xiangpi

新虫 (初入文坛)

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一般PCR 30个循环够了吧!
20楼2012-11-26 22:22:12
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