应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建 碱基突变 缺失 原因
242/3返回列表上一页123下一页
查看: 2380  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-26 05:48:05
如果目的片段不大，用什么酶都应该可以的，但PCR尽量不要采用过高的循环数。如果目的片段较长，建议使用高保真酶。

35个循环 多了？？
赞一下 回复此楼
11楼2012-11-26 08:53:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 08:15:36
突变成终止密码子的概率挺大的……
问题肯定是出在PCR，假如你用的胶回收的话还有可能是紫外照太久了……
要么还是用高保真酶吧，你这出现概率挺大的话说明你的片段不怎么短

突变是因为紫外照射？？ 控制在多长时间以内会比较安全呢
赞一下 回复此楼
12楼2012-11-26 08:54:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
10楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:52:36
我用的酶也是说是高保真的，还加A呢 到底保真性需要到什么程度才可以啊...

加A的肯定不是高保真。。。
赞一下 回复此楼
13楼2012-11-26 10:16:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by gongeleven at 2012-11-26 10:16:34
加A的肯定不是高保真。。。...

我看说明书上写的好像是中混合酶  因为我那个是改良的载体 跟t载体似的，我合计加a正好啊   它跟我之前用的一个酶  我看保真性写的一样的啊
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2012-11-26 10:34:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
14楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 10:34:33
我看说明书上写的好像是中混合酶  因为我那个是改良的载体 跟t载体似的，我合计加a正好啊   它跟我之前用的一个酶  我看保真性写的一样的啊...

你那个应该是taq+pfu的混合酶，保真能力比pfu差，但要比taq好，纯高保真酶的话是不会加A的，反而会切掉A尾，很多国产公司都在推销这种混合酶，我用过天根的taq plus，很烂，加A效率奇差，还不如pfu扩增自己加A，我估计你是循环太多了，试试28个循环，然后换个高保真酶吧.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
15楼2012-11-26 11:11:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:54:09
突变是因为紫外照射？？ 控制在多长时间以内会比较安全呢...

我的意思是你如果是切胶回收的话，不是得在紫外光照射下回收么……紫外线是有可能导致DNA损伤，然后转化进细胞之后突变的~
没有一个固定的时间，总之在你力所能及的范围内尽快把胶切完应该就没问题的
赞一下 回复此楼
16楼2012-11-26 12:10:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-25 19:31:11
“很有可能突变后的序列对E.coli有毒”，这个是什么意思？？转化后升温生长，是指涂了平板以后，不在37°过夜，在室温培养出单克隆吗？？谢谢...

“很有可能突变后的序列对E.coli有毒”，这些序列转化后会翻译成对E.coli 生长代谢有影响的蛋白，E.coli出于对自身的保护，不会让该序列正常的翻译，就会出现缺失，终止密码子等。
“转化后升温生长，是指涂了平板以后，不在37°过夜，在室温培养出单克隆吗？？”，是的，就是把平板放在室温，大约两天长出克隆。
赞一下 回复此楼
北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
17楼2012-11-26 12:13:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:51:22
我用的全式金的 trans taq T DNA polymerase，看说明书上说也是高保真酶啊 ，

PCR是35循环
目标序列有的1kb有的2kb...

问题就出在这里，
1.建议楼走用Pfu, Kod，primestar等高保真酶，不要用混合酶
2. 建议楼主降低循环25个循环足以，加大模板的量，不知道楼上用什么作为模板
3. 楼主产物是连T-载体么？
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2012-11-26 18:55:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-26 18:55:57
问题就出在这里，
1.建议楼走用Pfu, Kod，primestar等高保真酶，不要用混合酶
2. 建议楼主降低循环25个循环足以，加大模板的量，不知道楼上用什么作为模板
3. 楼主产物是连T-载体么？...

你好，你说的这几个酶是什么公司的啊
自己反转录的cDNA作为模板

载体是改良过的，相当于连t载体
赞一下 回复此楼
19楼2012-11-26 22:09:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiangpi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般PCR 30个循环够了吧！
赞一下 回复此楼
20楼2012-11-26 22:22:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 芥末猫 的主题更新
242/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿华中农业071010，总分320求调剂 +5 困困困困坤坤 2026-03-20 6/300 2026-03-22 17:41 by hxsm
[考研] 一志愿东华大学化学070300，求调剂 +6 2117205181 2026-03-21 7/350 2026-03-22 14:59 by allen-yin
[考研] 考研调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-21 3/150 2026-03-21 20:04 by 无际的草原
[考研] 材料学硕333求调剂 +3 北道巷 2026-03-18 3/150 2026-03-21 18:17 by 学员8dgXkO
[考研] 311求调剂 +3 勇敢的小吴 2026-03-20 3/150 2026-03-21 17:40 by ColorlessPI
[考研] 313求调剂 +4 肆叁贰壹22 2026-03-19 4/200 2026-03-21 17:33 by ColorlessPI
[考研] 306求0703调剂一志愿华中师范 +5 纸鱼ly 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:11 by 学员8dgXkO
[考研] 279求调剂 +5 红衣隐官 2026-03-21 5/250 2026-03-21 14:59 by lature00
[考研] 265求调剂 +12 梁梁校校 2026-03-19 14/700 2026-03-21 13:38 by lature00
[考研] 085601调剂 358分 +3 zzzzggh 2026-03-20 4/200 2026-03-21 10:21 by luoyongfeng
[考研] 346求调剂[0856] +4 WayneLim327 2026-03-16 7/350 2026-03-21 04:02 by JourneyLucky
[考研] 一志愿中国石油大学（华东） 本科齐鲁工业大学 +3 石能伟 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:22 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂 +10 S.H1 2026-03-18 10/500 2026-03-20 23:51 by JourneyLucky
[考研] 求调剂一志愿南京航空航天大学289分 +3 @taotao 2026-03-19 3/150 2026-03-20 21:34 by JourneyLucky
[考研] 086500 325 求调剂 +3 领带小熊 2026-03-19 3/150 2026-03-20 18:38 by 尽舜尧1
[考研] 08工学调剂 +5 用户573181 2026-03-20 5/250 2026-03-20 15:47 by xia_2003
[考研] 085410人工智能专硕317求调剂（0854都可以） +4 xbxudjdn 2026-03-18 4/200 2026-03-20 09:07 by 不168
[考研] 材料考研调剂 +3 xwt。 2026-03-19 3/150 2026-03-19 11:22 by w沐阳w
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +8 小李0854 2026-03-16 8/400 2026-03-18 14:35 by 搏击518
[考研] 085601求调剂 +4 Du.11 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:08 by ruiyingmiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭