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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建 碱基突变 缺失 原因
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芥末猫

银虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-26 05:48:05
如果目的片段不大，用什么酶都应该可以的，但PCR尽量不要采用过高的循环数。如果目的片段较长，建议使用高保真酶。

35个循环 多了？？
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11楼2012-11-26 08:53:07
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芥末猫

银虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-26 08:15:36
突变成终止密码子的概率挺大的……
问题肯定是出在PCR，假如你用的胶回收的话还有可能是紫外照太久了……
要么还是用高保真酶吧，你这出现概率挺大的话说明你的片段不怎么短

突变是因为紫外照射？？ 控制在多长时间以内会比较安全呢
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12楼2012-11-26 08:54:09
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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10楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:52:36
我用的酶也是说是高保真的，还加A呢 到底保真性需要到什么程度才可以啊...

加A的肯定不是高保真。。。
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13楼2012-11-26 10:16:34
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by gongeleven at 2012-11-26 10:16:34
加A的肯定不是高保真。。。...

我看说明书上写的好像是中混合酶  因为我那个是改良的载体 跟t载体似的，我合计加a正好啊   它跟我之前用的一个酶  我看保真性写的一样的啊
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14楼2012-11-26 10:34:33
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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14楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 10:34:33
我看说明书上写的好像是中混合酶  因为我那个是改良的载体 跟t载体似的，我合计加a正好啊   它跟我之前用的一个酶  我看保真性写的一样的啊...

你那个应该是taq+pfu的混合酶，保真能力比pfu差，但要比taq好，纯高保真酶的话是不会加A的，反而会切掉A尾，很多国产公司都在推销这种混合酶，我用过天根的taq plus，很烂，加A效率奇差，还不如pfu扩增自己加A，我估计你是循环太多了，试试28个循环，然后换个高保真酶吧.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
15楼2012-11-26 11:11:13
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:54:09
突变是因为紫外照射？？ 控制在多长时间以内会比较安全呢...

我的意思是你如果是切胶回收的话，不是得在紫外光照射下回收么……紫外线是有可能导致DNA损伤，然后转化进细胞之后突变的~
没有一个固定的时间，总之在你力所能及的范围内尽快把胶切完应该就没问题的
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16楼2012-11-26 12:10:07
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-25 19:31:11
“很有可能突变后的序列对E.coli有毒”，这个是什么意思？？转化后升温生长，是指涂了平板以后，不在37°过夜，在室温培养出单克隆吗？？谢谢...

“很有可能突变后的序列对E.coli有毒”，这些序列转化后会翻译成对E.coli 生长代谢有影响的蛋白，E.coli出于对自身的保护，不会让该序列正常的翻译，就会出现缺失，终止密码子等。
“转化后升温生长，是指涂了平板以后，不在37°过夜，在室温培养出单克隆吗？？”，是的，就是把平板放在室温，大约两天长出克隆。
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
17楼2012-11-26 12:13:06
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-11-26 08:51:22
我用的全式金的 trans taq T DNA polymerase，看说明书上说也是高保真酶啊 ，

PCR是35循环
目标序列有的1kb有的2kb...

问题就出在这里，
1.建议楼走用Pfu, Kod，primestar等高保真酶，不要用混合酶
2. 建议楼主降低循环25个循环足以，加大模板的量，不知道楼上用什么作为模板
3. 楼主产物是连T-载体么？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2012-11-26 18:55:57
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-26 18:55:57
问题就出在这里，
1.建议楼走用Pfu, Kod，primestar等高保真酶，不要用混合酶
2. 建议楼主降低循环25个循环足以，加大模板的量，不知道楼上用什么作为模板
3. 楼主产物是连T-载体么？...

你好，你说的这几个酶是什么公司的啊
自己反转录的cDNA作为模板

载体是改良过的，相当于连t载体
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19楼2012-11-26 22:09:32
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xiangpi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般PCR 30个循环够了吧！
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20楼2012-11-26 22:22:12
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