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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 目的基因表达载体的构建问题~请指教
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一面之缘1988

新虫 (小有名气)

[求助] 目的基因表达载体的构建问题~请指教

本人新人一名，知识匮乏，想请教大家一点关于表达载体的问题~~
当目的基因序列测出来后，老师让我做个表达，看看目的基因的表达产物怎样，好像是先要把目的基因PCR一下，然后再酶切，再将表达载体也用相同的酶切一下，露出相同的粘性末端，再连到表达载体上，转入感受态细胞中，增殖表达，SDS-PAGE验证。我想问下这个PCR引物是怎么设计呀，有什么要求，而且怎么保证酶切不会切断目的基因呢，表达产物又该怎么检测？
谢谢各位了~~
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1楼 2012-12-06 10:14:13
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karlgu18

新虫 (小有名气)
兄弟，你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板，他应当知道你没做过，或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。
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2楼2012-12-06 10:42:52
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午夜的月光

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励新虫交流！ 2012-12-07 11:52:01
引物设计有几个原则，去查一下书，很好查。最重要的是退火温度和引物自身不要成二聚体（DNA MAN 等软件可以分析）。在目的基因上下游各选取25个左右的碱基，注意目的基因的正负链，利用DNA MAN分析即可。用软件分析目的基因的酶切位点，在引物两端加酶切位点的时候不要有目的基因内酶切位点。表达产物一是看蛋白胶条带，若是酶，可以进一步测酶活
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3楼2012-12-06 17:07:35
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一面之缘1988

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-06 10:42:52
兄弟，你确定你在这儿应助。我觉得这些东西你问问你老板，他应当知道你没做过，或者直接找你们学校的做过分子生物学的人。这个比较简单的。

呵呵  也是~~不过老板忙 主要是外面的业务~~师兄我已经麻烦到不好意思再麻烦的地步了 呵呵 不过我也觉得得再厚脸皮一下了~
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4楼2012-12-07 09:41:53
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hs19880208

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在设计PCR引物的时候你就应该加相应的酶切位点了。酶切位点加入后PCR得到的产物就带有酶切位点（一般双酶切位点）。酶切过夜后，酶切产物过一下胶回收的试剂盒，把酶切后的小的片段去除。每个酶切位点都有独立识别位点。构建好的质粒在DH5a里克隆，抽质粒，转化到BL21里，用IPTG诱导，跑SDS-PAGE胶，用考亮染色，再脱色就可以看到表达的蛋白了。
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5楼2013-03-27 15:44:13
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这个不算太难的，先看表达载体有哪些合适的酶切位点，比如NdeI,NcoI这样识别序列有ATG起始密码子的，再看看目的基因含不含有这些位点，含有就不好连接了，挑好位点，计算下读码框是否正确，保证核糖体结合位点后的第一个ATG与目的基因是间隔3的倍数个碱基。下游的位点更好选，如果有6xHis标签，想融合表达的话，就注意下要是同一读码框，同时利用载体的终止密码子，如果没有这样的需要，就利用目的基因本身的终止密码子好了。基本是这样，具体还是看看书吧。
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为什么
6楼2013-07-09 23:07:10
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Jane_Eyre

新虫 (初入文坛)
首先，你要分析一下你的目的基因，看是否含有你要用的酶的酶切位点，一面被切断，确定没有酶切位点之后，再设计引物， 目的基因两端的引物要添加相应的酶切位点和酶所对应的保护碱基就可以
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不忘初心
7楼2014-08-26 09:55:20
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