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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体转农杆菌后的基因丢失问题
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 表达载体转农杆菌后的基因丢失问题 已有2人参与

各位大侠，本人最近遇到一些怪事，我构建好表达载体后，转入农杆菌C58C1，在相应抗生素板上挑取单克隆，菌液PCR后，可以检测到表达载体的抗生素基因，也可以检测到载体的某一固定片段，但是唯独检测不到构建到表达载体上的目的基因。之前，先从大肠杆菌中提取的质粒即这个表达载体，多对引物检测都没问题，目的基因也在。不知是不是在转化农杆菌的过程中载体上的目的基因丢失了？有没有这个可能呢？
求解啊，先谢谢啦！
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认真是一种习惯
1楼 2014-06-24 17:59:53
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zmj521good: 金币+1 2014-06-24 20:33:32
可能只是转了个空载体进去
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2楼2014-06-24 20:27:04
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-06-24 20:27:04
可能只是转了个空载体进去

载体在转化农杆菌前，是从阳性克隆提取的，且经过PCR验证了，是有目的基因片段的。所以应该没有被空载体污染。
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认真是一种习惯
3楼2014-06-24 20:33:19
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
zmj521good(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-25 08:28:06
zmj521good: 金币+1 2014-06-25 09:43:14
引用回帖:
3楼: Originally posted by zmj521good at 2014-06-24 20:33:19
载体在转化农杆菌前，是从阳性克隆提取的，且经过PCR验证了，是有目的基因片段的。所以应该没有被空载体污染。...

个人认为目的片段从表达载体上丢失的概率非常低，所以推测更有可能是空载体污染。可以在你插入位点一端设计引物测下载体序列，就能确定是哪种情况了。
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4楼2014-06-24 23:39:50
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zmj521good

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2014-06-24 23:39:50
个人认为目的片段从表达载体上丢失的概率非常低，所以推测更有可能是空载体污染。可以在你插入位点一端设计引物测下载体序列，就能确定是哪种情况了。...

之前在entry clone中已经测过序了，所以LR反应后的expression clone就没有测，应该序列是正确的，我现在又把那个质粒再重新转导DH5α中，再挑单克隆，应该这回不会存在可能的空载体污染了。
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认真是一种习惯
5楼2014-06-26 11:44:37
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zmj521good at 2014-06-26 11:44:37
之前在entry clone中已经测过序了，所以LR反应后的expression clone就没有测，应该序列是正确的，我现在又把那个质粒再重新转导DH5α中，再挑单克隆，应该这回不会存在可能的空载体污染了。...

LR反应后的表达载体应该也要测序验证。
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6楼2014-06-26 15:01:34
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zmj521good: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-06-26 23:05:47
这基本上可以肯定你转化的不是目标质粒，重新做下试试，如果问题还存在再说

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7楼2014-06-26 15:39:15
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caitlin0626

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zmj521good: 金币+1 2014-06-30 22:38:56
是细胞的返祖现象吗？对转进的质粒丢失的现象？

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8楼2014-06-27 14:41:59
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