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116093626

新虫 (小有名气)

[交流] 双元表达载体 农杆菌EHA105

我想用农杆菌EHA105构建双元表达载体，我手上现在有pcambia1301，和空的农杆菌EHA105，是不是还需要一个带有Vir基因的辅助质粒。将1301和辅助质粒一起转到农杆菌里？
多谢大家!
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1楼 2011-05-25 20:27:08
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咸鱼

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
116093626(金币+1):谢谢参与
jhu132llh(金币+5, EPI+1): 是滴，鼓励积极帮助新虫 2011-05-26 09:27:05
引用回帖:
Originally posted by 116093626 at 2011-05-25 20:27:08:
我想用农杆菌EHA105构建双元表达载体，我手上现在有pcambia1301，和空的农杆菌EHA105，是不是还需要一个带有Vir基因的辅助质粒。将1301和辅助质粒一起转到农杆菌里？
多谢大家!

不需要，你需要将你的基因先克隆到一个有启动子的载体上，然后将启动子一起切下来连接到pCambia1301上，然后转化EHA105即可。因为1301在多克隆位点前无启动子。
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Bella0224
2楼2011-05-25 21:01:14
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116093626

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): 积极提问交流奖 2011-05-26 09:27:35
引用回帖:
Originally posted by 咸鱼 at 2011-05-25 21:01:14:
不需要，你需要将你的基因先克隆到一个有启动子的载体上，然后将启动子一起切下来连接到pCambia1301上，然后转化EHA105即可。因为1301在多克隆位点前无启动子。

双元表达载体不是一个质粒带有t-dna 一个质粒带Vir基因么？1301上也没有Vir基因呀
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3楼2011-05-25 21:27:45
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jinyuw

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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jhu132llh(金币+2): 鼓励积极交流 2011-05-30 09:27:59
敢问二楼的，农杆菌EHA104和EHA105有和区别呀，我正在做EHA104的转化。
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4楼2011-05-29 21:18:09
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Bella0224

金虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
297353楼: Originally posted by 咸鱼 at 2011-05-25 21:01:14
不需要，你需要将你的基因先克隆到一个有启动子的载体上，然后将启动子一起切下来连接到pCambia1301上，然后转化EHA105即可。因为1301在多克隆位点前无启动子。...

我也在做利用农杆菌的双元表达载体，请问这位虫友，我是否也一样要把我的目的基因克隆岛一个含有启动子的载体上呢？这个载体怎么选择呢？还是有常用的，还是都可以呢？

之后将启动子切下连接到我的另外含T-DNA的载体上，直接转化进入我的农杆菌感受态细胞就可以了么？
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5楼2013-03-13 17:02:20
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Bella0224

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
298673楼: Originally posted by 116093626 at 2011-05-25 21:27:45
双元表达载体不是一个质粒带有t-dna 一个质粒带Vir基因么？1301上也没有Vir基因呀...

同问。。。楼主我和你做的东西差不多，在构建载体方面也好头痛。。。。


我手里也有一个含t-DNA的载体，但是vir怎么办？我好糊涂。。。。
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6楼2013-03-14 14:08:51
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
2484603楼: Originally posted by Bella0224 at 2013-03-13 17:02:20
我也在做利用农杆菌的双元表达载体，请问这位虫友，我是否也一样要把我的目的基因克隆岛一个含有启动子的载体上呢？这个载体怎么选择呢？还是有常用的，还是都可以呢？

之后将启动子切下连接到我的另外含T-DNA的 ...

朋友挖得一手好坟...
你的基因是要做什么用的呢？超表达？在特定组织表达？你的目标植物是什么？
最普通的情况是，让一个基因在拟南芥里面超表达。这样直接改造常用的pCAMBIA1301就可以了，通过酶切连接的方法用这个基因的cds替换掉pCAMBIA1301的GUS编码区，然后用这个改造后的载体转化eha105，再用eha105转拟南芥。
vir什么的不用管。eha105里面本身就有。
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7楼2013-03-14 17:13:53
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海尤希

新虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
2484940楼: Originally posted by XOooZzz at 2013-03-14 17:13:53
朋友挖得一手好坟...
你的基因是要做什么用的呢？超表达？在特定组织表达？你的目标植物是什么？
最普通的情况是，让一个基因在拟南芥里面超表达。这样直接改造常用的pCAMBIA1301就可以了，通过酶切连接的方法用 ...

我的目标植物是水稻，就是要将GFP整合上去，可以直接替换GUS，借用它的启动子吗？还是说要自己重新连接启动子然后连接到MCS？？

我被启动子搞晕了。。
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8楼2013-03-24 11:41:18
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
2487735楼: Originally posted by 海尤希 at 2013-03-24 11:41:18
我的目标植物是水稻，就是要将GFP整合上去，可以直接替换GUS，借用它的启动子吗？还是说要自己重新连接启动子然后连接到MCS？？

我被启动子搞晕了。。...

自带的35s启动子在水稻里也有活性。用玉米范素启动子也可以，据说活性更强。看你自己的实验要求了。
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9楼2013-03-24 13:55:45
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