应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有关原核表达载体构建方面的问题
111/2返回列表12下一页
查看: 2066  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xingyun789

金虫 (小有名气)

[求助] 有关原核表达载体构建方面的问题 已有1人参与

我将我的目的片段用BamHI和NotI进行双酶切，pET32a载体也是用这两个酶进行双酶切，然后将我的目的片段同这个载体进行连接，将连接的产物转化BL21感受态，然后涂平板，平板上长出了单菌落，挑取单菌落进行培养，然而进行菌落PCR的时候，并没有出现相应的目的条带。我用的是T7通用引物以及特异引物进行的检测，其中，T7通用引物用的退火温度是58度。出现这样的原因，还望各位能给解答一下，谢谢。。。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-03 09:06:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bolysu

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xingyun789: 金币+5 2014-07-03 10:09:25
本帖内容被屏蔽
2楼2014-07-03 09:54:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2014-07-03 09:54:54
这两个酶都不太好用，你有没有用酶切后的载体做对照？可能对照也一样能长出来

谢谢你的回复，我试一下。。。
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-03 10:09:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

随风飘摇11

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:02:30
想不通你怎么把连接产物转化BL21感受态的，这是表达菌株。是不是应该先转DH5α，构建成功测序没问题然后再转到BL21表达

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
天道酬勤
4楼2014-07-04 07:55:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 08:59:02
1 这两个酶都是很常见的酶，所以一般克隆还是比较容易构建的。
2 建议你转TG1或者DH5a等克隆宿主，如果你的表达产物对细胞有一定的抑制，那么确实存在得不到克隆的情况。
3 确定你的质粒和核酸的质量~这个是首先要确定的。
赞一下 回复此楼
致良知
5楼2014-07-04 08:54:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:02:44
同4楼。

BL21你转进去以后，得到的质粒非常少。可能会造成误判的现象。   先转DH5a，构建成功后，直接转质粒到BL21即可。
赞一下 回复此楼
6楼2014-07-04 09:11:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

泥鳅越钻越深

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 08:59:33
之前一直做酶切连接相关的工作，说一下我的一点见解。是不是你提取的酶切后的片段不纯或者量太低，连接没连上。你可以提出质粒，跑个电泳，看大小与预期是否一致。或者酶切看能不能切出目的片段。T7的退火温度没问题，还有个重要原因，你延伸的时间够吗？
赞一下 回复此楼
Decision Is So Important !
7楼2014-07-07 08:36:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-04 07:55:35
想不通你怎么把连接产物转化BL21感受态的，这是表达菌株。是不是应该先转DH5α，构建成功测序没问题然后再转到BL21表达

当时也是为了赶时间，就省略了中间的一步，不过，还好在重新挑取的菌落中得到了相应的转化菌株
赞一下 回复此楼
8楼2014-07-08 00:14:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by quiller2000 at 2014-07-04 08:54:17
1 这两个酶都是很常见的酶，所以一般克隆还是比较容易构建的。
2 建议你转TG1或者DH5a等克隆宿主，如果你的表达产物对细胞有一定的抑制，那么确实存在得不到克隆的情况。
3 确定你的质粒和核酸的质量~这个是首先要 ...

质粒和核酸质量对转化和表达影响大吗？我的载体大约5900bp，目的片段约1300bp
赞一下 回复此楼
9楼2014-07-08 00:16:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 泥鳅越钻越深 at 2014-07-07 08:36:59
之前一直做酶切连接相关的工作，说一下我的一点见解。是不是你提取的酶切后的片段不纯或者量太低，连接没连上。你可以提出质粒，跑个电泳，看大小与预期是否一致。或者酶切看能不能切出目的片段。T7的退火温度没问题 ...

因为我的目的片段加上载体本身的片段大约2000bp左右，我用一般的taq酶去做，延伸时间一般是2分钟
赞一下 回复此楼
10楼2014-07-08 00:17:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xingyun789 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 8/400 2026-08-04 06:17 by k7OM8YghWbkC
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 8/400 2026-08-04 06:15 by k7OM8YghWbkC
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 6/300 2026-08-04 06:10 by k7OM8YghWbkC
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 9/450 2026-08-04 06:07 by k7OM8YghWbkC
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 4/200 2026-08-04 04:54 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 6/300 2026-08-04 04:47 by k7OM8YghWbkC
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 9/450 2026-08-04 03:56 by kf2781974
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 8/400 2026-08-04 03:21 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 12/600 2026-08-04 03:17 by k7OM8YghWbkC
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
[高分子] UV压敏胶开发 +3 ichall 2026-07-30 5/250 2026-08-03 14:40 by Sunrisepay
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 16/800 2026-08-03 12:23 by fuweiguochen
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +19 低垂的野花 2026-07-31 25/1250 2026-08-03 09:25 by gy116024
[基金申请] 2026年国自然面上资助率 +16 布布和一二 2026-07-30 22/1100 2026-08-03 09:20 by gy116024
[教师之家] 基础研究怎么拉横向，学校到款任务越来越多，难以完成 拉横向，都有哪些途径啊 +8 锦衣卫寒战 2026-07-28 12/600 2026-08-03 08:22 by syl200707
[基金申请] 微信指数没变化，科研之友没阅读 +15 wangze12014 2026-07-28 19/950 2026-08-02 20:05 by 蔡棒棒菂
[考博] 2027年申博 50+3 射雕英雄胜 2026-07-30 3/150 2026-08-02 09:36 by lfy8008
[高分子] HXDI做水性聚氨酯乳液，是不是特别容易出渣 15+3 yuyusuv 2026-07-29 3/150 2026-07-31 09:21 by huizingga
[基金申请] 系统今天又提示维护了，估计离放榜不远了 +11 winnerche 2026-07-29 15/750 2026-07-30 23:08 by jnhyjjm
[基金申请] 你们的时间戳变了吗 +3 archvillain 2026-07-30 4/200 2026-07-30 18:53 by levinzhwen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭