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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 关于原核表达载体构建，跪求~~~~
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于原核表达载体构建，跪求~~~~ 已有2人参与

生物新手，有两个问题想求助一下：
1.现在要构建一个原核表达载体，我查的有两种方案，第一种是将目的基因PCR后直接连接到表达载体，再转化到表达菌株中，第二种是把目的基因连接到克隆载体，再酶切后再连接到表达载体，最后再转化到表达菌种，请问第二步中的克隆菌株有必要嘛？哪种方案比较可行？
2.在得到cDNA后，第一种是通过设计引物反转录得到目的基因的DNA，再对它双酶切，第二种是设计两端含有酶切位点的引物并添加保护碱基，再通过反转录直接得到双酶切后的目的基因，哪种比较可行？谢谢~~~~~~~~~~
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1楼 2014-04-01 08:59:32
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lihuahan(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流经验！ 2014-04-01 23:47:49
懂你的意思了。。。。
你所谓的pMD应该是个T/A克隆载体吧？
我一般不这样干，多出一轮克隆，浪费时间
但是遇见很难克隆的片段，比如怎么也拿不到太多的情况下
先T/A克隆获得片段是上策

但是即便是这样，跟酶切位点保护碱基也没有关系，你即便是做好T/A克隆的准备，也最好先就带上酶切位点，如果很容易拿到，直接克隆到表达载体不就完事了？
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lihuahan
6楼2014-04-01 22:51:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lihuahan(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励热心回帖交流 2014-04-01 13:29:22
混乱，一篇混乱。
第一个问题
不明白为什么还有个“克隆质粒”？
你要表达某个基因，你就直接把这段基因片段插到你的表达载体就可以了。克隆载体是最基本的载体，可以装片段的载体几乎都可以叫克隆载体，表达载体至少可以说是“可以表达的克隆载体”。
倒是后面一段可能需要点理解，那为什么表达载体要经过“克隆菌”到“表达菌”的过程呢？
一般而言，表达载体都是在克隆菌里面做克隆鉴定的，不建议直接转化表达菌，因为表达载体在表达菌中的情况比较复杂，可能因为泄露表达等原因导致表达菌生长受阻。
第二个问题
这个“反转录"不是这样乱用的
我不太明白你的意思
你所谓的cDNA，就是mRNA做反转录之后的cDNA第一链，
”通过反转录直接得到双酶切后的目的基因“
这到底是什么意思？
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2楼2014-04-01 09:18:55
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-01 18:31:09
第一种方法吧，常规的方法，不过克隆载体完全可以不用啊，PCR完后直接酶切连到表达载体上就行，中间的克隆菌株还是要保存下的，因为质粒在克隆菌株中要稳定的多，不会重排/丢失，直接转到表达菌中不太好
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3楼2014-04-01 17:30:35
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-01 09:18:55
混乱，一篇混乱。
第一个问题
不明白为什么还有个“克隆质粒”？
你要表达某个基因，你就直接把这段基因片段插到你的表达载体就可以了。克隆载体是最基本的载体，可以装片段的载体几乎都可以叫克隆载体，表达载体 ...

1.我看到有的人做的时候是在得到目的基因的DNA后，把DNA插入到pMD中，再对pMD双酶切，然后再对表达载体双酶切，把从pMD双酶切得到的目的片段再插入表达载体。
2.就是再得到cDNA第一链后，设计的引物再反转录PCR后可直接得到带有双酶切位点的目的基因。

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4楼2014-04-01 22:39:50
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lihuahan at 2014-04-01 22:41:52
中间的克隆菌株是啥？
...

DH5a Top10不都是克隆菌株嘛
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8楼2014-04-02 10:12:29
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普通回帖

lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaopeiliang at 2014-04-01 17:30:35
第一种方法吧，常规的方法，不过克隆载体完全可以不用啊，PCR完后直接酶切连到表达载体上就行，中间的克隆菌株还是要保存下的，因为质粒在克隆菌株中要稳定的多，不会重排/丢失，直接转到表达菌中不太好

中间的克隆菌株是啥？

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5楼2014-04-01 22:41:52
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-01 22:51:47
懂你的意思了。。。。
你所谓的pMD应该是个T/A克隆载体吧？
我一般不这样干，多出一轮克隆，浪费时间
但是遇见很难克隆的片段，比如怎么也拿不到太多的情况下
先T/A克隆获得片段是上策

但是即便是这样，跟酶 ...

哦哦，明白了~灰常感谢~~~~~~

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7楼2014-04-01 23:18:22
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-01 09:18:55
混乱，一篇混乱。
第一个问题
不明白为什么还有个“克隆质粒”？
你要表达某个基因，你就直接把这段基因片段插到你的表达载体就可以了。克隆载体是最基本的载体，可以装片段的载体几乎都可以叫克隆载体，表达载体 ...

你好，有几个问题想请教一下，1.在原核表达载体构建的时候，从目的基因的CDS序列里应该怎么找阅读框呢？现在已经有cDNA的第一链，是把目的基因的阅读框给公司再告诉他们酶切位点就可以得到两端带有酶切位点的引物嘛？2.原核表达载体应该怎么选择尼？我后期是纯化目的蛋白，pET-30a可行吗？如果可行的话，我看它的BamHI酶切位点是识别GGA三联密码子开始的阅读框，是不是要在引物的保护碱基后边加上GGA呢？

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9楼2014-04-30 10:24:59
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lihuahan at 2014-04-30 10:24:59
你好，有几个问题想请教一下，1.在原核表达载体构建的时候，从目的基因的CDS序列里应该怎么找阅读框呢？现在已经有cDNA的第一链，是把目的基因的阅读框给公司再告诉他们酶切位点就可以得到两端带有酶切位点的引物嘛 ...

你不是已经知道CDS了么？CDS就是你的ORF
我估计你就是在考虑顺框的问题，要是你用的酶切位点不顺框，添加几个碱基让它顺了就行了
纯化蛋白选载体，讲究多了去了。。。
要用什么tag？在哪个宿主表达？用什么表达系统？蛋白表达定位在哪？
一时难以回答。。。
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10楼2014-04-30 10:51:37
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