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关于原核表达载体构建，跪求~~~~ 已有2人参与
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生物新手，有两个问题想求助一下： 1.现在要构建一个原核表达载体，我查的有两种方案，第一种是将目的基因PCR后直接连接到表达载体，再转化到表达菌株中，第二种是把目的基因连接到克隆载体，再酶切后再连接到表达载体，最后再转化到表达菌种，请问第二步中的克隆菌株有必要嘛？哪种方案比较可行？ 2.在得到cDNA后，第一种是通过设计引物反转录得到目的基因的DNA，再对它双酶切，第二种是设计两端含有酶切位点的引物并添加保护碱基，再通过反转录直接得到双酶切后的目的基因，哪种比较可行？谢谢~~~~~~~~~~ |
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lihuahan6楼2014-04-01 22:51:47
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【答案】应助回帖
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混乱，一篇混乱。 第一个问题 不明白为什么还有个“克隆质粒”？ 你要表达某个基因，你就直接把这段基因片段插到你的表达载体就可以了。克隆载体是最基本的载体，可以装片段的载体几乎都可以叫克隆载体，表达载体至少可以说是“可以表达的克隆载体”。 倒是后面一段可能需要点理解，那为什么表达载体要经过“克隆菌”到“表达菌”的过程呢？ 一般而言，表达载体都是在克隆菌里面做克隆鉴定的，不建议直接转化表达菌，因为表达载体在表达菌中的情况比较复杂，可能因为泄露表达等原因导致表达菌生长受阻。 第二个问题 这个“反转录"不是这样乱用的 我不太明白你的意思 你所谓的cDNA，就是mRNA做反转录之后的cDNA第一链， ”通过反转录直接得到双酶切后的目的基因“ 这到底是什么意思？ |
2楼2014-04-01 09:18:55
xiaopeiliang
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