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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 关于原核表达载体构建，跪求~~~~
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于原核表达载体构建，跪求~~~~ 已有2人参与

生物新手，有两个问题想求助一下：
1.现在要构建一个原核表达载体，我查的有两种方案，第一种是将目的基因PCR后直接连接到表达载体，再转化到表达菌株中，第二种是把目的基因连接到克隆载体，再酶切后再连接到表达载体，最后再转化到表达菌种，请问第二步中的克隆菌株有必要嘛？哪种方案比较可行？
2.在得到cDNA后，第一种是通过设计引物反转录得到目的基因的DNA，再对它双酶切，第二种是设计两端含有酶切位点的引物并添加保护碱基，再通过反转录直接得到双酶切后的目的基因，哪种比较可行？谢谢~~~~~~~~~~
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1楼 2014-04-01 08:59:32
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lihuahan(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流经验！ 2014-04-01 23:47:49
懂你的意思了。。。。
你所谓的pMD应该是个T/A克隆载体吧？
我一般不这样干，多出一轮克隆，浪费时间
但是遇见很难克隆的片段，比如怎么也拿不到太多的情况下
先T/A克隆获得片段是上策

但是即便是这样，跟酶切位点保护碱基也没有关系，你即便是做好T/A克隆的准备，也最好先就带上酶切位点，如果很容易拿到，直接克隆到表达载体不就完事了？
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lihuahan
6楼2014-04-01 22:51:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lihuahan(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励热心回帖交流 2014-04-01 13:29:22
混乱，一篇混乱。
第一个问题
不明白为什么还有个“克隆质粒”？
你要表达某个基因，你就直接把这段基因片段插到你的表达载体就可以了。克隆载体是最基本的载体，可以装片段的载体几乎都可以叫克隆载体，表达载体至少可以说是“可以表达的克隆载体”。
倒是后面一段可能需要点理解，那为什么表达载体要经过“克隆菌”到“表达菌”的过程呢？
一般而言，表达载体都是在克隆菌里面做克隆鉴定的，不建议直接转化表达菌，因为表达载体在表达菌中的情况比较复杂，可能因为泄露表达等原因导致表达菌生长受阻。
第二个问题
这个“反转录"不是这样乱用的
我不太明白你的意思
你所谓的cDNA，就是mRNA做反转录之后的cDNA第一链，
”通过反转录直接得到双酶切后的目的基因“
这到底是什么意思？
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2楼2014-04-01 09:18:55
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-01 18:31:09
第一种方法吧，常规的方法，不过克隆载体完全可以不用啊，PCR完后直接酶切连到表达载体上就行，中间的克隆菌株还是要保存下的，因为质粒在克隆菌株中要稳定的多，不会重排/丢失，直接转到表达菌中不太好
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3楼2014-04-01 17:30:35
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-01 09:18:55
混乱，一篇混乱。
第一个问题
不明白为什么还有个“克隆质粒”？
你要表达某个基因，你就直接把这段基因片段插到你的表达载体就可以了。克隆载体是最基本的载体，可以装片段的载体几乎都可以叫克隆载体，表达载体 ...

1.我看到有的人做的时候是在得到目的基因的DNA后，把DNA插入到pMD中，再对pMD双酶切，然后再对表达载体双酶切，把从pMD双酶切得到的目的片段再插入表达载体。
2.就是再得到cDNA第一链后，设计的引物再反转录PCR后可直接得到带有双酶切位点的目的基因。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-04-01 22:39:50
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