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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体构建老不成功，求助！
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sjjsy7

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达载体构建老不成功，求助！

本人构水稻基因的原核表达载体（PET-28a），胶回收后老是连不成功，以前也没再意就成功了，但这次老不行;现在想请教一下各位虫友你们在构载体时体系是怎么样的，我的是目的片段：载体=6:1.5  1ul T4酶 1ul buffer 0.5u水。TAKARA的ligation kit 也用过，也不行。希望大家给点意见！！！
           下面是我回收后的电泳图，是8ul上样！

图片1.jpg
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1楼 2012-09-17 12:44:37
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sjjsy7: 金币+1 2012-09-17 22:17:26
我20微升的体系加 buffer2微升，楼主可以看看连接酶的说明书

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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有时候，一句话，可以改变未来
2楼2012-09-17 12:54:40
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sjjsy7: 金币+2, ★有帮助 2012-09-17 22:17:01
检没检测过片段里是否有突变位点？
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未来不是梦
3楼2012-09-17 15:16:07
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尚慕寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这图上哪个是载体哪个是片段？怎么有3个大小不同的条带？而且都太淡了！
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高山仰止，景行行止，虽不能至，心向往之。
4楼2012-09-17 20:55:55
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 尚慕寒 at 2012-09-17 20:55:55
你这图上哪个是载体哪个是片段？怎么有3个大小不同的条带？而且都太淡了！

最后两个是载体，前一个是没有切过的对照，是啊，浓度确实很低！！
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5楼2012-09-17 22:16:16
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-09-17 15:16:07
检没检测过片段里是否有突变位点？

没有，这个该怎么检测？？
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6楼2012-09-17 22:16:51
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-17 12:54:40
我20微升的体系加 buffer2微升，楼主可以看看连接酶的说明书

谢谢，我在看看
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7楼2012-09-17 22:17:21
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-18 15:51:44
没有酶切的载体应该主要是超螺旋吧？超螺旋质粒应该比线性化的质粒跑得快才对？你的marker也用的不合适，建议挑选一个可以分析质粒大小的marker。
关于双酶切的具体定量设计，建议参考double digestion designer，小木虫上可以找到
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8楼2012-09-17 22:40:50
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272401213

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做了6、7个比例才长了一个！最大了载体和片段比是6:1！多试几个比例看看，祝成功！
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YNWA
9楼2012-09-18 08:47:32
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尚慕寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

8ul上样都只有这个亮度，浓度确实太低了。载体浓度太低不容易长出斑来，尝试连接体系中加大载体的量吧。建议你重新切载体，我一般连接前跑胶，上样都是1ul。
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高山仰止，景行行止，虽不能至，心向往之。
10楼2012-09-18 08:57:38
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