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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体构建老不成功，求助！
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lixilei1314

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-18 15:52:00
连接的比例不是体积比，要是摩尔比。载体一般要0.03pmol，而目的片段需要0.1-0.3pmol. 具体网上有公式可以换算。
另外，提质粒的时候尽量把菌液摇的浓一些，我一般让菌液的OD达到0.5左右的时候才提质粒，用4ml提，最高一次我提的浓度达到了>600ng/ul。
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11楼2012-09-18 09:47:52
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-18 15:52:08
sjjsy7: 金币+2, ★有帮助 2012-09-19 12:48:19
在确定浓度不方便的情况下，我都是目的片段：载体=1:4，连接用的宝生物的Solution 1，10μl体系加5μl。楼主回收产物虽然亮度偏低，但是应该只影响转化效率，不会影响转化成功与否。之所以不成功可能还有别的原因，建议楼主回查一下。祝好运！
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12楼2012-09-18 10:57:56
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by sjjsy7 at 2012-09-17 22:16:51
没有，这个该怎么检测？？...

你是用的双酶切吗？如果是的话，载体上或者片段上是不是有突变位点，导致你载体或者片段两端都是同一个酶，这样肯定是连不上的。我原来实验就出现过这种状况。你可以测个序，或者用这两个酶分别切，看看是不是用一个酶作用完就可以切开。
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未来不是梦
13楼2012-09-18 14:52:11
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-09-18 14:52:11
你是用的双酶切吗？如果是的话，载体上或者片段上是不是有突变位点，导致你载体或者片段两端都是同一个酶，这样肯定是连不上的。我原来实验就出现过这种状况。你可以测个序，或者用这两个酶分别切，看看是不是用一 ...

哦！知道了！谢谢！
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14楼2012-09-19 12:48:14
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by joan198108 at 2012-09-18 10:57:56
在确定浓度不方便的情况下，我都是目的片段：载体=1:4，连接用的宝生物的Solution 1，10μl体系加5μl。楼主回收产物虽然亮度偏低，但是应该只影响转化效率，不会影响转化成功与否。之所以不成功可能还有别的原因， ...

好的，我在看看，谢谢！
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15楼2012-09-19 12:48:40
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lixilei1314 at 2012-09-18 09:47:52
连接的比例不是体积比，要是摩尔比。载体一般要0.03pmol，而目的片段需要0.1-0.3pmol. 具体网上有公式可以换算。
另外，提质粒的时候尽量把菌液摇的浓一些，我一般让菌液的OD达到0.5左右的时候才提质粒，用4ml提， ...

谢啦吗！我再看看！
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16楼2012-09-19 12:49:15
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 尚慕寒 at 2012-09-18 08:57:38
8ul上样都只有这个亮度，浓度确实太低了。载体浓度太低不容易长出斑来，尝试连接体系中加大载体的量吧。建议你重新切载体，我一般连接前跑胶，上样都是1ul。

没办法，回收的盒子不太好！我在试一试！
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17楼2012-09-19 12:51:01
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 272401213 at 2012-09-18 08:47:32
我做了6、7个比例才长了一个！最大了载体和片段比是6:1！多试几个比例看看，祝成功！

谢谢！！
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18楼2012-09-19 12:51:30
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-09-17 22:40:50
没有酶切的载体应该主要是超螺旋吧？超螺旋质粒应该比线性化的质粒跑得快才对？你的marker也用的不合适，建议挑选一个可以分析质粒大小的marker。
关于双酶切的具体定量设计，建议参考double digestion designer， ...

不可能是环形的吗？我问了一下导师，他说可能是环形的！
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19楼2012-09-19 12:52:51
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by joan198108 at 2012-09-18 10:57:56
在确定浓度不方便的情况下，我都是目的片段：载体=1:4，连接用的宝生物的Solution 1，10μl体系加5μl。楼主回收产物虽然亮度偏低，但是应该只影响转化效率，不会影响转化成功与否。之所以不成功可能还有别的原因， ...

你的比例是不是错了？应该是目的片段：载体=4:1才对吧。。。
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20楼2012-09-22 00:15:00
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