6楼: Originally posted by sjjsy7 at 2012-09-17 22:16:51
没有，这个该怎么检测？？...

13楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-09-18 14:52:11
你是用的双酶切吗？如果是的话，载体上或者片段上是不是有突变位点，导致你载体或者片段两端都是同一个酶，这样肯定是连不上的。我原来实验就出现过这种状况。你可以测个序，或者用这两个酶分别切，看看是不是用一 ...

12楼: Originally posted by joan198108 at 2012-09-18 10:57:56
在确定浓度不方便的情况下，我都是目的片段：载体=1:4，连接用的宝生物的Solution 1，10μl体系加5μl。楼主回收产物虽然亮度偏低，但是应该只影响转化效率，不会影响转化成功与否。之所以不成功可能还有别的原因， ...

11楼: Originally posted by lixilei1314 at 2012-09-18 09:47:52
连接的比例不是体积比，要是摩尔比。载体一般要0.03pmol，而目的片段需要0.1-0.3pmol. 具体网上有公式可以换算。
另外，提质粒的时候尽量把菌液摇的浓一些，我一般让菌液的OD达到0.5左右的时候才提质粒，用4ml提， ...

10楼: Originally posted by 尚慕寒 at 2012-09-18 08:57:38
8ul上样都只有这个亮度，浓度确实太低了。载体浓度太低不容易长出斑来，尝试连接体系中加大载体的量吧。建议你重新切载体，我一般连接前跑胶，上样都是1ul。

9楼: Originally posted by 272401213 at 2012-09-18 08:47:32
我做了6、7个比例才长了一个！最大了载体和片段比是6:1！多试几个比例看看，祝成功！

8楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-09-17 22:40:50
没有酶切的载体应该主要是超螺旋吧？超螺旋质粒应该比线性化的质粒跑得快才对？你的marker也用的不合适，建议挑选一个可以分析质粒大小的marker。
关于双酶切的具体定量设计，建议参考double digestion designer， ...

12楼: Originally posted by joan198108 at 2012-09-18 10:57:56
在确定浓度不方便的情况下，我都是目的片段：载体=1:4，连接用的宝生物的Solution 1，10μl体系加5μl。楼主回收产物虽然亮度偏低，但是应该只影响转化效率，不会影响转化成功与否。之所以不成功可能还有别的原因， ...