24小时热门版块排行榜    

查看: 2048  |  回复: 20
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

sjjsy7

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达载体构建老不成功,求助!

本人构水稻基因的原核表达载体(PET-28a),胶回收后老是连不成功,以前也没再意就成功了,但这次老不行;现在想请教一下各位虫友你们在构载体时体系是怎么样的,我的是目的片段:载体=6:1.5  1ul T4酶 1ul buffer 0.5u水。TAKARA的ligation kit 也用过,也不行。希望大家给点意见!!!
           下面是我回收后的电泳图,是8ul上样!

图片1.jpg
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixilei1314

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-18 15:52:00
连接的比例不是体积比,要是摩尔比。载体一般要0.03pmol,而目的片段需要0.1-0.3pmol. 具体网上有公式可以换算。
另外,提质粒的时候尽量把菌液摇的浓一些,我一般让菌液的OD达到0.5左右的时候才提质粒,用4ml提,最高一次我提的浓度达到了>600ng/ul。
11楼2012-09-18 09:47:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答

ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
sjjsy7: 金币+1 2012-09-17 22:17:26
我20微升的体系加 buffer2微升,楼主可以看看连接酶的说明书

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
有时候,一句话,可以改变未来
2楼2012-09-17 12:54:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sjjsy7: 金币+2, 有帮助 2012-09-17 22:17:01
检没检测过片段里是否有突变位点?
未来不是梦
3楼2012-09-17 15:16:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

尚慕寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这图上哪个是载体哪个是片段?怎么有3个大小不同的条带?而且都太淡了!
高山仰止,景行行止,虽不能至,心向往之。
4楼2012-09-17 20:55:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见