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sjjsy7

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达载体构建老不成功,求助!

本人构水稻基因的原核表达载体(PET-28a),胶回收后老是连不成功,以前也没再意就成功了,但这次老不行;现在想请教一下各位虫友你们在构载体时体系是怎么样的,我的是目的片段:载体=6:1.5  1ul T4酶 1ul buffer 0.5u水。TAKARA的ligation kit 也用过,也不行。希望大家给点意见!!!
           下面是我回收后的电泳图,是8ul上样!

图片1.jpg
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by sjjsy7 at 2012-09-17 22:16:51
没有,这个该怎么检测??...

你是用的双酶切吗?如果是的话,载体上或者片段上是不是有突变位点,导致你载体或者片段两端都是同一个酶,这样肯定是连不上的。我原来实验就出现过这种状况。你可以测个序,或者用这两个酶分别切,看看是不是用一个酶作用完就可以切开。
未来不是梦
13楼2012-09-18 14:52:11
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
sjjsy7: 金币+1 2012-09-17 22:17:26
我20微升的体系加 buffer2微升,楼主可以看看连接酶的说明书

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
有时候,一句话,可以改变未来
2楼2012-09-17 12:54:40
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sjjsy7: 金币+2, ★有帮助 2012-09-17 22:17:01
检没检测过片段里是否有突变位点?
未来不是梦
3楼2012-09-17 15:16:07
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尚慕寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这图上哪个是载体哪个是片段?怎么有3个大小不同的条带?而且都太淡了!
高山仰止,景行行止,虽不能至,心向往之。
4楼2012-09-17 20:55:55
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