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wh6125

铁虫 (初入文坛)

[求助] 做了原核表达,表达量很低,求助~~ 已有8人参与

用pET-28a构建的原核表达载体,带N端His标签,测序、酶切都正确,菌株用的是BL21(DE3),16℃ 8h、20h及30℃ 3h都有表达,但是表达量很低(见附件中红框标注),求助是应该优化表达条件还是换载体试试呢?这种表达量不能纯化吧?
图中依次为Marker,空载体(诱导前、后),目的蛋白(1、2诱导前),目的蛋白(1,2诱导后)
后面三条浅的是诱导后的空载体及目的蛋白沉淀
做了原核表达,表达量很低,求助~~
IMG_0730.jpg
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

楼主可以试试延长诱导时间,加大诱导剂量
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
2楼2014-03-06 15:07:55
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wh6125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-06 15:07:55
楼主可以试试延长诱导时间,加大诱导剂量

我用的是1mM的IPTG,还可以再加大用量么?
3楼2014-03-06 15:40:21
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wh6125 at 2014-03-06 15:40:21
我用的是1mM的IPTG,还可以再加大用量么?...

可以试试看,你可以做三个,一个延长时间,一个加大剂量,一个两者都有
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
4楼2014-03-06 15:56:39
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wh6125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-06 15:56:39
可以试试看,你可以做三个,一个延长时间,一个加大剂量,一个两者都有...

好的,谢谢
5楼2014-03-06 16:00:17
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changbinzh

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-07 13:39:33
或者换个载体 我以前也遇到你这样的情况 换个载体表达量就上来了
6楼2014-03-07 11:18:15
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-09 00:55:09
IPTG不一定越高越好,我用过0.1和0.5mM的,效果都不错~关于诱导时间,要是延长时间不建议培养温度过高,防止蛋白降解,做表达量就是要各种摸条件,过程很痛苦,生活很艰辛~
7楼2014-03-07 14:20:01
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秋水素心

银虫 (小有名气)

37度试试?
认真过好每一天!
8楼2014-03-08 22:18:37
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秋水素心

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 秋水素心 at 2014-03-08 22:18:37
37度试试?

30度3h貌似时间有点短
认真过好每一天!
9楼2014-03-08 22:19:53
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-09 11:15:25
共转pRARE2试试看,提高稀有密码子的表达。
希望对你有帮助。
10楼2014-03-09 09:40:01
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