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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 做了原核表达，表达量很低，求助~~
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wh6125

铁虫 (初入文坛)

[求助] 做了原核表达，表达量很低，求助~~ 已有8人参与

用pET-28a构建的原核表达载体，带N端His标签，测序、酶切都正确，菌株用的是BL21(DE3)，16℃ 8h、20h及30℃ 3h都有表达，但是表达量很低（见附件中红框标注），求助是应该优化表达条件还是换载体试试呢？这种表达量不能纯化吧？
图中依次为Marker，空载体（诱导前、后），目的蛋白（1、2诱导前），目的蛋白（1，2诱导后）
后面三条浅的是诱导后的空载体及目的蛋白沉淀
做了原核表达，表达量很低，求助~~
IMG_0730.jpg
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1楼 2014-03-06 14:10:38
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
楼主可以试试延长诱导时间，加大诱导剂量
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
2楼2014-03-06 15:07:55
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wh6125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-06 15:07:55
楼主可以试试延长诱导时间，加大诱导剂量

我用的是1mM的IPTG,还可以再加大用量么？
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3楼2014-03-06 15:40:21
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wh6125 at 2014-03-06 15:40:21
我用的是1mM的IPTG,还可以再加大用量么？...

可以试试看，你可以做三个，一个延长时间，一个加大剂量，一个两者都有
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
4楼2014-03-06 15:56:39
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wh6125

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-06 15:56:39
可以试试看，你可以做三个，一个延长时间，一个加大剂量，一个两者都有...

好的，谢谢
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5楼2014-03-06 16:00:17
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changbinzh

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-07 13:39:33
或者换个载体 我以前也遇到你这样的情况 换个载体表达量就上来了
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6楼2014-03-07 11:18:15
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-09 00:55:09
IPTG不一定越高越好，我用过0.1和0.5mM的，效果都不错~关于诱导时间，要是延长时间不建议培养温度过高，防止蛋白降解，做表达量就是要各种摸条件，过程很痛苦，生活很艰辛~
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7楼2014-03-07 14:20:01
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秋水素心

银虫 (小有名气)
37度试试？
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认真过好每一天！
8楼2014-03-08 22:18:37
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秋水素心

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 秋水素心 at 2014-03-08 22:18:37
37度试试？

30度3h貌似时间有点短
赞一下 回复此楼
认真过好每一天！
9楼2014-03-08 22:19:53
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-09 11:15:25
共转pRARE2试试看，提高稀有密码子的表达。
希望对你有帮助。
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10楼2014-03-09 09:40:01
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