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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因的原核表达

要看一个基因的原核表达,已转到BL21中。接着接种摇到OD600为0.6,再加诱导剂IPTG至终浓度为1mM,诱导3h,稀释1000000倍,涂板,Amp抗性。过夜培养,板子上的菌落数好多,无法统计,这是怎么回事?
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huanghznd

金虫 (小有名气)

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-03 13:19:46
maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:45
要看一个基因在原核中是否表达,直接在IPTG诱导之后,破胞跑SDS-PAGE电泳看看有没有目的条带,就可以确定。
不知LZ为什么要诱导之后涂板,本身就是抗AMP的,那涂板当然会长很多很多了。
2楼2013-08-03 11:22:11
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-03 13:19:52
maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:36
看基因表达为何要统计菌落数呢,SDS-PAGE就可以确定。你可否说一下你最会涂板的目的,难道跟你的载体有关。接种摇瓶前你是否按比例加入Amp+,如果没有加的话会造成杂菌或无质粒菌的大量繁殖。
成功,就是成为你想成为的人
3楼2013-08-03 11:31:50
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-03 13:19:59
maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:29
做蛋白表达鉴定不需要诱导后突变计数的,如果你的蛋白以包涵体的形式表达,可以诱导之后离心加缓冲液超声破碎,如果不是包涵体形式表达,直接离心煮样,之后跑SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝考染看有没有目的蛋白条带就行了~~~希望对你有帮助哦
4楼2013-08-03 12:04:43
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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by huanghznd at 2013-08-03 11:22:11
要看一个基因在原核中是否表达,直接在IPTG诱导之后,破胞跑SDS-PAGE电泳看看有没有目的条带,就可以确定。
不知LZ为什么要诱导之后涂板,本身就是抗AMP的,那涂板当然会长很多很多了。

基因与低温有关,想看一下在低温下基因是否表达
5楼2013-08-03 14:00:20
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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangbighui at 2013-08-03 11:31:50
看基因表达为何要统计菌落数呢,SDS-PAGE就可以确定。你可否说一下你最会涂板的目的,难道跟你的载体有关。接种摇瓶前你是否按比例加入Amp+,如果没有加的话会造成杂菌或无质粒菌的大量繁殖。

低温处理看是否有菌落生长
6楼2013-08-03 14:01:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:17
基因是否表达可以检测mRNA、蛋白或者代谢产物,而不是检测菌的生长情况。所以不清楚你为什么要涂板计数菌落。BL21是表达蛋白的菌株,你应该是想检测蛋白产物的。IPTG诱导后你应该破碎菌体跑SDS-PAGE,与未诱导的菌比较,看是否诱导出目的蛋白。
7楼2013-08-04 01:16:45
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Sthunder

木虫 (正式写手)

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maweiwei2008: 金币+4 2013-08-04 09:40:02
OD已经0.6,在加上3 h培养,涂板自然会有很多菌落!你目的蛋白表达与否与宿主菌分裂没有直接相关,除非你的蛋白特殊!如果你的蛋白在低温下对菌株生长有所影响,建议测一下在低温条件下的生长曲线,记得同时做对照!Good luck!
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8楼2013-08-04 04:05:33
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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 04:05:33
OD已经0.6,在加上3 h培养,涂板自然会有很多菌落!你目的蛋白表达与否与宿主菌分裂没有直接相关,除非你的蛋白特殊!如果你的蛋白在低温下对菌株生长有所影响,建议测一下在低温条件下的生长曲线,记得同时做对照! ...

生长曲线怎么做呢,谢谢
9楼2013-08-04 09:39:54
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Sthunder

木虫 (正式写手)

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引用回帖:
9楼: Originally posted by maweiwei2008 at 2013-08-04 09:39:54
生长曲线怎么做呢,谢谢...

最好转个空载做对照,同时接种含你目的基因/空载的菌,长到一定OD后,等量加到等体系的新鲜培养基中,在低温下培养,然后不动时间点定时测定两瓶对于的OD,然后做一个曲线,两曲线一对照,结果自然就非常明了了!
互助互励,共奋共进!!
10楼2013-08-04 10:18:51
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