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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因的原核表达
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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因的原核表达

要看一个基因的原核表达，已转到BL21中。接着接种摇到OD600为0.6，再加诱导剂IPTG至终浓度为1mM，诱导3h，稀释1000000倍，涂板，Amp抗性。过夜培养，板子上的菌落数好多，无法统计，这是怎么回事？
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1楼 2013-08-03 10:26:36
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-03 13:19:46
maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:45
要看一个基因在原核中是否表达，直接在IPTG诱导之后，破胞跑SDS-PAGE电泳看看有没有目的条带，就可以确定。
不知LZ为什么要诱导之后涂板，本身就是抗AMP的，那涂板当然会长很多很多了。
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2楼2013-08-03 11:22:11
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-03 13:19:52
maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:36
看基因表达为何要统计菌落数呢，SDS-PAGE就可以确定。你可否说一下你最会涂板的目的，难道跟你的载体有关。接种摇瓶前你是否按比例加入Amp+,如果没有加的话会造成杂菌或无质粒菌的大量繁殖。
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成功，就是成为你想成为的人
3楼2013-08-03 11:31:50
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-03 13:19:59
maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:29
做蛋白表达鉴定不需要诱导后突变计数的，如果你的蛋白以包涵体的形式表达，可以诱导之后离心加缓冲液超声破碎，如果不是包涵体形式表达，直接离心煮样，之后跑SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝考染看有没有目的蛋白条带就行了～～～希望对你有帮助哦
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4楼2013-08-03 12:04:43
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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huanghznd at 2013-08-03 11:22:11
要看一个基因在原核中是否表达，直接在IPTG诱导之后，破胞跑SDS-PAGE电泳看看有没有目的条带，就可以确定。
不知LZ为什么要诱导之后涂板，本身就是抗AMP的，那涂板当然会长很多很多了。

基因与低温有关，想看一下在低温下基因是否表达
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5楼2013-08-03 14:00:20
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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangbighui at 2013-08-03 11:31:50
看基因表达为何要统计菌落数呢，SDS-PAGE就可以确定。你可否说一下你最会涂板的目的，难道跟你的载体有关。接种摇瓶前你是否按比例加入Amp+,如果没有加的话会造成杂菌或无质粒菌的大量繁殖。

低温处理看是否有菌落生长
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6楼2013-08-03 14:01:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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maweiwei2008: 金币+2 2013-08-04 09:40:17
基因是否表达可以检测mRNA、蛋白或者代谢产物，而不是检测菌的生长情况。所以不清楚你为什么要涂板计数菌落。BL21是表达蛋白的菌株，你应该是想检测蛋白产物的。IPTG诱导后你应该破碎菌体跑SDS-PAGE，与未诱导的菌比较，看是否诱导出目的蛋白。
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7楼2013-08-04 01:16:45
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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maweiwei2008: 金币+4 2013-08-04 09:40:02
OD已经0.6，在加上3 h培养，涂板自然会有很多菌落！你目的蛋白表达与否与宿主菌分裂没有直接相关，除非你的蛋白特殊！如果你的蛋白在低温下对菌株生长有所影响，建议测一下在低温条件下的生长曲线，记得同时做对照！Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
8楼2013-08-04 04:05:33
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maweiwei2008

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 04:05:33
OD已经0.6，在加上3 h培养，涂板自然会有很多菌落！你目的蛋白表达与否与宿主菌分裂没有直接相关，除非你的蛋白特殊！如果你的蛋白在低温下对菌株生长有所影响，建议测一下在低温条件下的生长曲线，记得同时做对照！ ...

生长曲线怎么做呢，谢谢
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9楼2013-08-04 09:39:54
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by maweiwei2008 at 2013-08-04 09:39:54
生长曲线怎么做呢，谢谢...

最好转个空载做对照，同时接种含你目的基因/空载的菌，长到一定OD后，等量加到等体系的新鲜培养基中，在低温下培养，然后不动时间点定时测定两瓶对于的OD，然后做一个曲线，两曲线一对照，结果自然就非常明了了！
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互助互励，共奋共进！！
10楼2013-08-04 10:18:51
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