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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有关原核表达载体构建方面的问题
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xingyun789

金虫 (小有名气)

[求助] 有关原核表达载体构建方面的问题 已有1人参与

我将我的目的片段用BamHI和NotI进行双酶切，pET32a载体也是用这两个酶进行双酶切，然后将我的目的片段同这个载体进行连接，将连接的产物转化BL21感受态，然后涂平板，平板上长出了单菌落，挑取单菌落进行培养，然而进行菌落PCR的时候，并没有出现相应的目的条带。我用的是T7通用引物以及特异引物进行的检测，其中，T7通用引物用的退火温度是58度。出现这样的原因，还望各位能给解答一下，谢谢。。。
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1楼 2014-07-03 09:06:20
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bolysu

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xingyun789: 金币+5 2014-07-03 10:09:25
本帖内容被屏蔽
2楼2014-07-03 09:54:54
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xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2014-07-03 09:54:54
这两个酶都不太好用，你有没有用酶切后的载体做对照？可能对照也一样能长出来

谢谢你的回复，我试一下。。。
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3楼2014-07-03 10:09:18
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:02:30
想不通你怎么把连接产物转化BL21感受态的，这是表达菌株。是不是应该先转DH5α，构建成功测序没问题然后再转到BL21表达

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
4楼2014-07-04 07:55:35
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 08:59:02
1 这两个酶都是很常见的酶，所以一般克隆还是比较容易构建的。
2 建议你转TG1或者DH5a等克隆宿主，如果你的表达产物对细胞有一定的抑制，那么确实存在得不到克隆的情况。
3 确定你的质粒和核酸的质量~这个是首先要确定的。
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致良知
5楼2014-07-04 08:54:17
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 15:02:44
同4楼。

BL21你转进去以后，得到的质粒非常少。可能会造成误判的现象。   先转DH5a，构建成功后，直接转质粒到BL21即可。
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6楼2014-07-04 09:11:10
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泥鳅越钻越深

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-07-08 08:59:33
之前一直做酶切连接相关的工作，说一下我的一点见解。是不是你提取的酶切后的片段不纯或者量太低，连接没连上。你可以提出质粒，跑个电泳，看大小与预期是否一致。或者酶切看能不能切出目的片段。T7的退火温度没问题，还有个重要原因，你延伸的时间够吗？
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Decision Is So Important !
7楼2014-07-07 08:36:59
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xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-04 07:55:35
想不通你怎么把连接产物转化BL21感受态的，这是表达菌株。是不是应该先转DH5α，构建成功测序没问题然后再转到BL21表达

当时也是为了赶时间，就省略了中间的一步，不过，还好在重新挑取的菌落中得到了相应的转化菌株
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8楼2014-07-08 00:14:04
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xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by quiller2000 at 2014-07-04 08:54:17
1 这两个酶都是很常见的酶，所以一般克隆还是比较容易构建的。
2 建议你转TG1或者DH5a等克隆宿主，如果你的表达产物对细胞有一定的抑制，那么确实存在得不到克隆的情况。
3 确定你的质粒和核酸的质量~这个是首先要 ...

质粒和核酸质量对转化和表达影响大吗？我的载体大约5900bp，目的片段约1300bp
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9楼2014-07-08 00:16:28
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xingyun789

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 泥鳅越钻越深 at 2014-07-07 08:36:59
之前一直做酶切连接相关的工作，说一下我的一点见解。是不是你提取的酶切后的片段不纯或者量太低，连接没连上。你可以提出质粒，跑个电泳，看大小与预期是否一致。或者酶切看能不能切出目的片段。T7的退火温度没问题 ...

因为我的目的片段加上载体本身的片段大约2000bp左右，我用一般的taq酶去做，延伸时间一般是2分钟
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10楼2014-07-08 00:17:59
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