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原核表达载体构建- 遇到的一些问题···
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最近构建了一表达载体，载体图谱如图（pET28a） 自己在Hind III 和 Xho I 加入了 目的基因CDS区(去除密码子)+九聚精氨酸（9R，一种穿膜肽） 转化进BL21（DE3） 用IPTG 诱导表达 试验目的： 生产出带穿膜肽 和 标签的 目的蛋白，标签的目的是方便纯化 问题： 1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下 2. 自己构建的载体： 在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His 和 一个T7）??? 3. 原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下 翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？ 还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？ 4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译 ？ 如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列 （如 后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。 自己是新手，望各位高手解答，谢谢了！！！ 真心想知道自己构建的载体是否存在问题  图片2.png |
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 核酸方面 |
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2楼2013-09-03 11:22:50
wangchclove
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zyx335588
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1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下 大肠杆菌自身不含有T7 RNA聚合酶，BL21（DE3）等溶源菌中DE3区整合有T7噬菌体的RNA聚合酶基因，受乳糖操纵子的控制。在不加诱导物如IPTG时，由于阻遏物的结合，细菌本身并不表达T7RNA聚合酶。pET28a载体的目的基因启动子是T7-lac 类型，其后目的基因的表达需要T7RNA聚合酶，在不加IPTG时，不会大量表达T7 RNA聚合酶的同时，阻遏物也会结合于lac启动子上，从而尽可能减少目的基因本底表达。关于T7表达系统的具体信息，建议你看一下以下手册的第30-34页：http://www.merckmillipore.com/ch ... ;DocumentSource=GDS 2. 自己构建的载体： 在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His 和 一个T7）??? His标签前面是有起始密码子的位于NcoI酶切位点内，其后还有三个氨基酸才是His标签；T7标签前的ATG已经不能称为起始密码子了，只是编码蛋氨酸的一个普通密码子而已。如果你的目的序列含有终止密码子，将会在终止密码子处终止，不会表达C端His标签。如果你的目的基因没加终止密码子，同时你用的是pET28a（而不是pET28b），使用Hind III 和 Xho I 酶切，你的插入片段在在xhoI前没加其他碱基（即反向引物除保护碱基及酶切位点外，酶切位点后没加其他碱基）的话，也不会表达C端His标签。此两种情况虽不会表达His标签，但让会表达一个长尾巴即载体图上XhoI之后的那些氨基酸。如果你用的是pET28b，同时满足上述条件，则会表达C端His标签。如果你用的是pET28a，同时你的插入片段在在xhoI前添加了2个碱基（即反向引物除保护碱基及酶切位点外，酶切位点后加了2个碱基）的话，也会表达C端His标签。总之，构建载体时有注意移码现象，后两种情况会表达三个标签。 3. 原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下 翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？ 还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？ 正确的表达是从RBS后的第一个起始密码子开始的，也就是从NcoI位点内的ATG开始翻译。由于你的目的基因位于该位点后，而两者间没有终止密码子，所以才能够融合表达His tag -- T7 tag -- your target，如果你的插入基因没有终止密码子，在your target后还有其他序列。 4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译 ？ 如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列 （如 后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。 正确的表达情况是到遇到的第一个终止密码子（不是终止子）结束，如果没有终止密码子，在终止子处由于特殊的结构，也有可能会造成转录的终止。一般来说商业载体在终止子前都会有终止密码子的，对照2中说的几种情况看一下你的是在什么地方终止吧。 注意该载体图同时标示了pET28a(+)，pET28b（+），pET28c(+)，这三个载体只有几个碱基的差别，但是最终的表达情况是不一样的，所以一定要注意移码现象。 |
4楼2013-09-04 21:38:30
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非常感谢您的回复！！！ 仔细阅读过之后还存在如下疑问： 1. 我现在基本确定 自己设计的载体存在移码突变，我跟你解释一下，你看对不对？？？ 自己的方案： pET28a载体HindIII +目的基因(如Oct4，去除终止密码子)+9聚精氨酸+Xho I) 翻译是从rbs 后的第一个ATG开始的，然而从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是 121，不为3的倍数，所以存在移码突变。 这解释对嘛？ 这也是不能合成后续His-tag的原因嘛 ？当然蛋白也不是我想要的 如果从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是3的倍数，就不存在突变，后面的His-tag标签也能正常表达了吧 ，并且发现His-tag后面有一个TGA，这个能起到终止密码子的作用嘛？？？ 非常期待您的再次回复！！！ 自己现在在设计新的方案，到时候可能还要向你请教，谢谢！！！自己是新手，不过也会多给你红包的，谢谢！ |
5楼2013-09-05 20:24:03
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也非常你的回复，还能帮我看看一下问题嘛？ . 我现在基本确定 自己设计的载体存在移码突变，我跟你解释一下，你看对不对？？？ 自己的方案： pET28a载体HindIII +目的基因(如Oct4，去除终止密码子)+9聚精氨酸+Xho I) 翻译是从rbs 后的第一个ATG开始的，然而从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是 121，不为3的倍数，所以存在移码突变。 这解释对嘛？ 这也是不能合成后续His-tag的原因嘛 ？当然蛋白也不是我想要的 如果从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是3的倍数，就不存在突变，后面的His-tag标签也能正常表达了吧 ，并且发现His-tag后面有一个TGA，这个能起到终止密码子的作用嘛？？？ 非常期待您的再次回复！！！ 自己现在在设计新的方案，到时候可能还要向你请教，谢谢！！！自己是新手，不过也会多给你红包的，谢谢！ |
6楼2013-09-05 20:36:50
