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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 原核表达载体构建- 遇到的一些问题···
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散步者high

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达载体构建- 遇到的一些问题···

最近构建了一表达载体，载体图谱如图（pET28a）

自己在Hind III  和 Xho I  加入了  目的基因CDS区(去除密码子)+九聚精氨酸（9R，一种穿膜肽）    转化进BL21（DE3） 用IPTG 诱导表达
试验目的： 生产出带穿膜肽 和 标签的 目的蛋白，标签的目的是方便纯化

问题：
1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下
2. 自己构建的载体：   在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His  和 一个T7）???   
3.  原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下 翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？  还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？
4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译 ？ 如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列 （如 后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。

自己是新手，望各位高手解答，谢谢了！！！  
真心想知道自己构建的载体是否存在问题
原核表达载体构建- 遇到的一些问题···
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老六，好样的···
1楼 2013-09-02 15:01:15
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散步者high

新虫 (小有名气)
看来要沉了···
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老六，好样的···
2楼2013-09-03 11:22:50
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wangchclove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢回答 2013-09-05 06:17:41
散步者high: 金币+2 2013-09-05 11:39:05
1.大肠杆菌本身不表达T7RNA聚合酶，而BL21（DE3）中人为的在其DE3区插入了T7RNA聚合酶基因，并利用乳糖操纵子控制其表达，这是IPTG诱导的原理。
2.3.翻译是在RBS 后首个ATG开始的，如果没有人为引入终止密码子，你这样是会带三个标签的，小心移码突变！
4.翻译是要遇到终止密码子的。
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Good
3楼2013-09-04 10:51:10
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zyx335588

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+5, 谢谢详细的回答 2013-09-05 06:17:14
散步者high: 金币+8 2013-09-05 11:39:00
1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下

大肠杆菌自身不含有T7 RNA聚合酶，BL21（DE3）等溶源菌中DE3区整合有T7噬菌体的RNA聚合酶基因，受乳糖操纵子的控制。在不加诱导物如IPTG时，由于阻遏物的结合，细菌本身并不表达T7RNA聚合酶。pET28a载体的目的基因启动子是T7-lac 类型，其后目的基因的表达需要T7RNA聚合酶，在不加IPTG时，不会大量表达T7 RNA聚合酶的同时，阻遏物也会结合于lac启动子上，从而尽可能减少目的基因本底表达。关于T7表达系统的具体信息，建议你看一下以下手册的第30-34页：http://www.merckmillipore.com/ch ... ;DocumentSource=GDS

2. 自己构建的载体：   在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His  和 一个T7）???   

His标签前面是有起始密码子的位于NcoI酶切位点内，其后还有三个氨基酸才是His标签；T7标签前的ATG已经不能称为起始密码子了，只是编码蛋氨酸的一个普通密码子而已。如果你的目的序列含有终止密码子，将会在终止密码子处终止，不会表达C端His标签。如果你的目的基因没加终止密码子，同时你用的是pET28a（而不是pET28b），使用Hind III  和 Xho I  酶切，你的插入片段在在xhoI前没加其他碱基（即反向引物除保护碱基及酶切位点外，酶切位点后没加其他碱基）的话，也不会表达C端His标签。此两种情况虽不会表达His标签，但让会表达一个长尾巴即载体图上XhoI之后的那些氨基酸。如果你用的是pET28b，同时满足上述条件，则会表达C端His标签。如果你用的是pET28a，同时你的插入片段在在xhoI前添加了2个碱基（即反向引物除保护碱基及酶切位点外，酶切位点后加了2个碱基）的话，也会表达C端His标签。总之，构建载体时有注意移码现象，后两种情况会表达三个标签。

3.  原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下 翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？  还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？

正确的表达是从RBS后的第一个起始密码子开始的，也就是从NcoI位点内的ATG开始翻译。由于你的目的基因位于该位点后，而两者间没有终止密码子，所以才能够融合表达His tag -- T7 tag -- your target，如果你的插入基因没有终止密码子，在your target后还有其他序列。

4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译 ？ 如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列 （如 后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。

正确的表达情况是到遇到的第一个终止密码子（不是终止子）结束，如果没有终止密码子，在终止子处由于特殊的结构，也有可能会造成转录的终止。一般来说商业载体在终止子前都会有终止密码子的，对照2中说的几种情况看一下你的是在什么地方终止吧。

注意该载体图同时标示了pET28a(+)，pET28b（+），pET28c(+)，这三个载体只有几个碱基的差别，但是最终的表达情况是不一样的，所以一定要注意移码现象。
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4楼2013-09-04 21:38:30
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散步者high

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zyx335588 at 2013-09-04 21:38:30
1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下

大肠杆菌自身不含有T7 RNA聚合酶，BL21（DE3）等溶源菌中DE3区整合有T7噬 ...

非常感谢您的回复！！！

仔细阅读过之后还存在如下疑问：

1. 我现在基本确定 自己设计的载体存在移码突变，我跟你解释一下，你看对不对？？？

自己的方案：
pET28a载体HindIII +目的基因(如Oct4，去除终止密码子)+9聚精氨酸+Xho I)
翻译是从rbs 后的第一个ATG开始的，然而从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是 121，不为3的倍数，所以存在移码突变。 这解释对嘛？  这也是不能合成后续His-tag的原因嘛 ？当然蛋白也不是我想要的      如果从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是3的倍数，就不存在突变，后面的His-tag标签也能正常表达了吧 ，并且发现His-tag后面有一个TGA，这个能起到终止密码子的作用嘛？？？

非常期待您的再次回复！！！

自己现在在设计新的方案，到时候可能还要向你请教，谢谢！！！自己是新手，不过也会多给你红包的，谢谢！
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老六，好样的···
5楼2013-09-05 20:24:03
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散步者high

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangchclove at 2013-09-04 10:51:10
1.大肠杆菌本身不表达T7RNA聚合酶，而BL21（DE3）中人为的在其DE3区插入了T7RNA聚合酶基因，并利用乳糖操纵子控制其表达，这是IPTG诱导的原理。
2.3.翻译是在RBS 后首个ATG开始的，如果没有人为引入终止密码子，你 ...

也非常你的回复，还能帮我看看一下问题嘛？  

. 我现在基本确定 自己设计的载体存在移码突变，我跟你解释一下，你看对不对？？？

自己的方案：
pET28a载体HindIII +目的基因(如Oct4，去除终止密码子)+9聚精氨酸+Xho I)
翻译是从rbs 后的第一个ATG开始的，然而从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是 121，不为3的倍数，所以存在移码突变。 这解释对嘛？  这也是不能合成后续His-tag的原因嘛 ？当然蛋白也不是我想要的      如果从ATG开始到HindIIIQ 前方的碱基数是3的倍数，就不存在突变，后面的His-tag标签也能正常表达了吧 ，并且发现His-tag后面有一个TGA，这个能起到终止密码子的作用嘛？？？

非常期待您的再次回复！！！

自己现在在设计新的方案，到时候可能还要向你请教，谢谢！！！自己是新手，不过也会多给你红包的，谢谢！
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老六，好样的···
6楼2013-09-05 20:36:50
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