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一面之缘1988

新虫 (小有名气)

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[求助] 目的基因表达载体的构建问题~请指教

本人新人一名，知识匮乏，想请教大家一点关于表达载体的问题~~
当目的基因序列测出来后，老师让我做个表达，看看目的基因的表达产物怎样，好像是先要把目的基因PCR一下，然后再酶切，再将表达载体也用相同的酶切一下，露出相同的粘性末端，再连到表达载体上，转入感受态细胞中，增殖表达，SDS-PAGE验证。我想问下这个PCR引物是怎么设计呀，有什么要求，而且怎么保证酶切不会切断目的基因呢，表达产物又该怎么检测？
谢谢各位了~~

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1楼 2012-12-06 10:14:13

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木虫 (著名写手)

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专业: 系统生物学

【答案】应助回帖

这个不算太难的，先看表达载体有哪些合适的酶切位点，比如NdeI,NcoI这样识别序列有ATG起始密码子的，再看看目的基因含不含有这些位点，含有就不好连接了，挑好位点，计算下读码框是否正确，保证核糖体结合位点后的第一个ATG与目的基因是间隔3的倍数个碱基。下游的位点更好选，如果有6xHis标签，想融合表达的话，就注意下要是同一读码框，同时利用载体的终止密码子，如果没有这样的需要，就利用目的基因本身的终止密码子好了。基本是这样，具体还是看看书吧。

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为什么

6楼2013-07-09 23:07:10

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