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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建
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冉冉猫

新虫 (初入文坛)
每一步都严格按要求试试、、、两个月得到寥寥无几的转化子，假阳性还一大片，快hold不住了
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11楼2011-11-17 21:17:41
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 冉冉猫 at 2011-11-17 21:17:41:
每一步都严格按要求试试、、、两个月得到寥寥无几的转化子，假阳性还一大片，快hold不住了

我做个两步克隆，两步都是单酶切，搞了2个月了才做完第一步，唉
共勉共勉
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12楼2011-11-17 21:39:35
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
12楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-17 21:39:35:
我做个两步克隆，两步都是单酶切，搞了2个月了才做完第一步，唉
共勉共勉

我也是单酶切滴
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
13楼2011-11-17 21:47:55
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冉冉猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-17 21:39:35:
我做个两步克隆，两步都是单酶切，搞了2个月了才做完第一步，唉
共勉共勉

我的是双酶切~~怀疑目的片段切的效果不好。。。加油加油
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14楼2011-11-17 22:31:51
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muscle920

禁虫 (小有名气)
林夕梦(金币+2): 再做了，其他的呢？还有么 2011-11-17 23:45:31
本帖内容被屏蔽
15楼2011-11-17 23:11:08
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 也有道理! 这个就是碰运气, 运气好就好连,运气不好就难连! 2011-11-19 18:56:38
说什么10K都很容易完全是不负责任，3K以上就很难连了，大于3K的链接效率就直线下降，各大公司的技术支持我都问过，大于3K的就是难连，楼主可以把你的片段发给那个说10K很容易的让他帮你弄。
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16楼2011-11-18 08:40:20
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★
wanhscn(金币+1): 不要过分相信那些技术支持,很多水平不行,不一定比我们实际做实验的人高! 2011-11-19 18:57:50
引用回帖:
8楼: Originally posted by srlee at 2011-11-17 20:31:40:
这个片段3.7Kb，载体7Kb连接应该是很好连接地，我们超过10kb的连接经常做也没有多大的问题，只是连接效率比小片段低一些。
至于连接要注意实验中的一些小细节问题：酶切割胶回收纯化是否干净？连接体系比例合不合 ...

表示完全不信，我连3点几K的时候也是一直连不上，咨询各大公司的技术支持，都说大于3K了效率直线下降，第一次听你说10K的都没多大问题。
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17楼2011-11-18 08:42:30
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

3.7不算太大吧。。。我也连接过3点几的。。。
连接时间长一些，关键还是连接体系和时间的选择上有些不合适。。。
改进一下就OK了。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
18楼2011-11-18 10:28:45
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
16楼: Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-11-18 08:40:20:
说什么10K都很容易完全是不负责任，3K以上就很难连了，大于3K的链接效率就直线下降，各大公司的技术支持我都问过，大于3K的就是难连，楼主可以把你的片段发给那个说10K很容易的让他帮你弄。

呵呵，是呢，好难连的
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
19楼2011-11-18 11:46:54
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
18楼: Originally posted by 天使托 at 2011-11-18 10:28:45:
3.7不算太大吧。。。我也连接过3点几的。。。
连接时间长一些，关键还是连接体系和时间的选择上有些不合适。。。
改进一下就OK了。。。

16度，连接过夜的，大概14个小时左右了，时间该没问题吧。每次都是10ul的体系，载体和片段3：1的
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
20楼2011-11-18 11:58:43
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