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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+5): 请不要动怒哈，也许那位虫友的用词不妥。肯定是可以连接的，否则就不会这样设计实验啦。我相信您是连接成功，也相信是有难度的。所以才来求助，求指教的呀 2011-11-18 13:17:01
引用回帖:
19楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 11:46:54:
呵呵，是呢，好难连的

刚吃过饭回到实验室打开小木虫看到与我相关的帖子，看了回帖我感到很吃惊，仔仔细细的又把我的回帖看了一遍，并招呼其他师兄弟姐妹再帮我看一下回帖也都表示没有问题的！
但是有一个哥们ID为“阿修罗Axuro “的回帖很具有挑战性，直接导致我中午吃饭消化不良。“说什么10K都很容易完全是不负责任，3K以上就很难连了，大于3K的链接效率就直线下降，各大公司的技术支持我都问过，大于3K的就是难连，楼主可以把你的片段发给那个说10K很容易的让他帮你弄。”“表示完全不信，我连3点几K的时候也是一直连不上，咨询各大公司的技术支持，都说大于3K了效率直线下降，第一次听你说10K的都没多大问题。”
本来是不想继续回复的，别人连不连的上实验做不做出来，管我什么事跟我又有什么关系呢？但看到回帖中“完全是不负责任”“楼主可以把你的片段发给那个说10K很容易的让他帮你弄。”本着我自己对自己说话负责任的态度以及以后能继续在小木虫混下去，我还是想确认一下连接10k以上的片段应该是没有问题的，本想把相关的实验图片都贴上去的，但还是算了，回头这哥们又说我这图片是ps的！
Nothing is impossible,自己没见识过的东西那就多看看书吧，别坐井观天说别人说话不负责任，也请那哥们注意以后自己的说话方式。
祝楼主实验顺利！
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21楼2011-11-18 12:47:37
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xupp

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+5): 呵呵，息怒啦，那位同学也是有点激动而已，您们的技术实在是很好啦，还请指教。大家好好探讨，和平探讨哈~~ 2011-11-18 13:19:11
引用回帖:
17楼: Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-11-18 08:42:30:
表示完全不信，我连3点几K的时候也是一直连不上，咨询各大公司的技术支持，都说大于3K了效率直线下降，第一次听你说10K的都没多大问题。

搞笑，我连过12k+31k的，12k+45k的，虽然效率低，但几十个克隆里肯定能有阳性的，各大公司的技术支持估计也是纸上谈兵没有实践过，至于说10k的基本连不上的童鞋们，我只能说你功夫不到，或者运气太差，但是无知的否定别人就太不好了。。。。。。实验顺利哦
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22楼2011-11-18 12:52:35
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

说得太笼统，没法回答！！！~
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每天坚持多一点，以后困难少一点！
23楼2011-11-18 14:08:48
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
23楼: Originally posted by 0624410024 at 2011-11-18 14:08:48:
说得太笼统，没法回答！！！~

额，bamh1单酶切的，takaraT4连接酶16度连接过夜，超级感受态30到45s转化，然后就是挑克隆，小抽，再次酶切鉴定了。可是要么没长克隆，要么是假阳性
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
24楼2011-11-18 14:23:51
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+3): 额，切2个小时也有的，超过四小时的也有呢 2011-11-18 14:54:47
引用回帖:
24楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 14:23:51:
额，bamh1单酶切的，takaraT4连接酶16度连接过夜，超级感受态30到45s转化，然后就是挑克隆，小抽，再次酶切鉴定了。可是要么没长克隆，要么是假阳性

BamHI酶切你切了多久啊 这个酶改进版的BamhI HF好些，普通的超过4个小时会乱切的，不知你切了多久
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25楼2011-11-18 14:49:02
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

★ ★
林夕梦(金币+5): 有道理呢，希望我好运啊，O(∩_∩)O谢谢 2011-11-18 17:11:58
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-11-19 18:58:57
引用回帖:
24楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 14:23:51:
额，bamh1单酶切的，takaraT4连接酶16度连接过夜，超级感受态30到45s转化，然后就是挑克隆，小抽，再次酶切鉴定了。可是要么没长克隆，要么是假阳性

你的酶如果是实验室经常用到的话，酶的问题就可以基本排除。你的转化过程也是你经常成功实验的过程的话也应该没问题。根据你的描述是没长克隆或者是假阳性，我自己感觉的话是不是你的大肠杆菌感受态有问题了呢？当然还有很多其他原因的，要一一排除的话你最好进行对照，没对照什么都不能解释的，只能在哪里胡乱猜测~~~望楼主好运~~~
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26楼2011-11-18 16:54:28
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
26楼: Originally posted by 0624410024 at 2011-11-18 16:54:28:
你的酶如果是实验室经常用到的话，酶的问题就可以基本排除。你的转化过程也是你经常成功实验的过程的话也应该没问题。根据你的描述是没长克隆或者是假阳性，我自己感觉的话是不是你的大肠杆菌感受态有问题了呢？ ...

都是实验室常用的，感受态没问题的，前几天做了个2.4kb的都成功啦。
再考虑双酶切呢
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27楼2011-11-18 17:09:10
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

引用回帖:
27楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 17:09:10:
都是实验室常用的，感受态没问题的，前几天做了个2.4kb的都成功啦。
再考虑双酶切呢

你可以考虑双酶切！你这个片段不是算太大哈！应该没问题的~~~
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28楼2011-11-18 17:12:51
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
28楼: Originally posted by 0624410024 at 2011-11-18 17:12:51:
你可以考虑双酶切！你这个片段不是算太大哈！应该没问题的~~~

但是要用到not1了，酶切位点为8个碱基额，还要加保护位点，岂不是酶切效率会很低呢
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
29楼2011-11-18 17:27:18
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liuxing5157

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by srlee at 2011-11-18 12:47:37:
刚吃过饭回到实验室打开小木虫看到与我相关的帖子，看了回帖我感到很吃惊，仔仔细细的又把我的回帖看了一遍，并招呼其他师兄弟姐妹再帮我看一下回帖也都表示没有问题的！
但是有一个哥们ID为“阿修罗Axuro “的 ...

完全同意你的看法，我虽然现在才研一，但目前构建的载体不下30个，什么样的片段没有连接过！！！他那句话太不负责任啦！
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30楼2011-11-18 22:07:31
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