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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~

[求助] 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建

如题，基因片段3.7Kb载体7Kb，Phage载体。
连接了几次都失败了。要么转化后没有长出克隆，要么长出来也是假阳性，小提质粒后酶切片段大小不对额
大片段不好连呢，求高手指教有妙招改进么？？
(转化采用的超级感受态细胞，42度30s)
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
1楼 2011-11-17 14:21:26
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

★ ★
林夕梦(金币+5): 有道理呢，希望我好运啊，O(∩_∩)O谢谢 2011-11-18 17:11:58
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-11-19 18:58:57
引用回帖:
24楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 14:23:51:
额，bamh1单酶切的，takaraT4连接酶16度连接过夜，超级感受态30到45s转化，然后就是挑克隆，小抽，再次酶切鉴定了。可是要么没长克隆，要么是假阳性

你的酶如果是实验室经常用到的话，酶的问题就可以基本排除。你的转化过程也是你经常成功实验的过程的话也应该没问题。根据你的描述是没长克隆或者是假阳性，我自己感觉的话是不是你的大肠杆菌感受态有问题了呢？当然还有很多其他原因的，要一一排除的话你最好进行对照，没对照什么都不能解释的，只能在哪里胡乱猜测~~~望楼主好运~~~
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每天坚持多一点，以后困难少一点！
26楼2011-11-18 16:54:28
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longrna

新虫 (正式写手)
贴上你的连接体系及条件嘛，用哪家公司的酶？
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伟大航线....
2楼2011-11-17 18:06:25
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longrna

新虫 (正式写手)
我们一般4度过夜连接，用NEB的酶
赞一下 回复此楼
伟大航线....
3楼2011-11-17 18:10:05
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2011-11-17 18:06:25:
贴上你的连接体系及条件嘛，用哪家公司的酶？

takara的连接酶，16度过夜的
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
4楼2011-11-17 18:34:36
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