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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
30楼: Originally posted by liuxing5157 at 2011-11-18 22:07:31:
完全同意你的看法，我虽然现在才研一，但目前构建的载体不下30个，什么样的片段没有连接过！！！他那句话太不负责任啦！

额，我也研一。不要纠结了哈。不要把气氛搞得太那啥了哈，只是为了学术讨论哈
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
31楼2011-11-18 22:12:45
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liuxing5157

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+5): 谢谢，但是我们的酶不一样呢，不过还是O(∩_∩)O谢谢 2011-11-18 22:14:49
给楼主一个体系，连接的体系，我们一直这样做。
连接比例的计算：目的基因（质量  ng）/目的基因片段大小（bp）：切后载体质量（ng）/切后载体片段大小（bp）=3:1~6:1。
我们一般先选定载体的质量为50ng，然后计算目的基因的质量。
我们用的是fermentas公司的T4连接酶，22度连接3~5h。

仅供参考，祝你实验顺利！
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32楼2011-11-18 22:13:57
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A406

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+2): 额，怎么交替啊，这倒没听过~~ 2011-11-18 22:16:47
连接上是可以的 只是效率的问题，可以考虑放PCR仪里4度一段时间，16度一度时间交替，连接过夜。当然两者的比例你要满足
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33楼2011-11-18 22:15:09
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liuxing5157

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 22:12:45:
额，我也研一。不要纠结了哈。不要把气氛搞得太那啥了哈，只是为了学术讨论哈

感觉他说话有点不负责   呵呵
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34楼2011-11-18 22:15:30
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
34楼: Originally posted by liuxing5157 at 2011-11-18 22:15:30:
感觉他说话有点不负责   呵呵

呵呵，理解万岁，和为贵哈
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
35楼2011-11-18 22:18:17
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+3): 恩，O(∩_∩)O谢谢，非常感谢 2011-11-19 00:15:43
引用回帖:
29楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 17:27:18:
但是要用到not1了，酶切位点为8个碱基额，还要加保护位点，岂不是酶切效率会很低呢

如果你认为你选择的酶切位点会影响你的酶切效率，你完全可以选择其他的哈！限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：
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每天坚持多一点，以后困难少一点！
36楼2011-11-18 22:59:52
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+2): 呵呵，那就ok,感谢大家的热心帮助和探讨哈，我会继续努力的哈 2011-11-19 00:15:02
引用回帖:
30楼: Originally posted by liuxing5157 at 2011-11-18 22:07:31:
完全同意你的看法，我虽然现在才研一，但目前构建的载体不下30个，什么样的片段没有连接过！！！他那句话太不负责任啦！

哈哈，谢谢你的支持！连接转化是分子生物学中最基本的操作，小片段确实不用考虑多少因素基本都能连的上，片段稍微大一点，如果不注意实验中的细节问题，连接效率可能直线下降甚至连不上，但很负责任的讲连接10k以上的片段并不是什么很难的事，因为我们经常可以搞定！对于那哥们的话我只好笑笑而已，早已不放在心上了！
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37楼2011-11-18 23:01:03
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+5): 额，是我打反了，是1：3 2011-11-21 12:09:41
引用回帖:
20楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 11:58:43:
16度，连接过夜的，大概14个小时左右了，时间该没问题吧。每次都是10ul的体系，载体和片段3：1的

载体和片段的比例是按照它们各自的浓度来定的。。。
连接之前先对载体和基因片段定量一下。。。然后再确定连接的比例！
一般情况下，片段应该多。你这明显是载体多，肯定是连接不上的。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
38楼2011-11-19 12:25:59
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花花贝

金虫 (知名作家)
感受态的效率验证了吗?
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39楼2011-11-19 15:06:08
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威斯布鲁克

铁虫 (初入文坛)
师姐做了好几次连接都没成，最近在换载体
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每个人都有自己的活法
40楼2012-02-10 13:43:20
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