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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~

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[求助] 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建

如题，基因片段3.7Kb载体7Kb，Phage载体。
连接了几次都失败了。要么转化后没有长出克隆，要么长出来也是假阳性，小提质粒后酶切片段大小不对额

大片段不好连呢，求高手指教有妙招改进么？？

(转化采用的超级感受态细胞，42度30s)

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许多奇迹，我们相信，才会实现……

1楼 2011-11-17 14:21:26

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liuxing5157

铁虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

林夕梦(金币+5): 谢谢，但是我们的酶不一样呢，不过还是O(∩_∩)O谢谢 2011-11-18 22:14:49

给楼主一个体系，连接的体系，我们一直这样做。
连接比例的计算：目的基因（质量 ng）/目的基因片段大小（bp）：切后载体质量（ng）/切后载体片段大小（bp）=3:1~6:1。
我们一般先选定载体的质量为50ng，然后计算目的基因的质量。
我们用的是fermentas公司的T4连接酶，22度连接3~5h。

仅供参考，祝你实验顺利！