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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~

[求助] 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建

如题,基因片段3.7Kb载体7Kb,Phage载体。
连接了几次都失败了。要么转化后没有长出克隆,要么长出来也是假阳性,小提质粒后酶切片段大小不对额
大片段不好连呢,求高手指教有妙招改进么??
(转化采用的超级感受态细胞,42度30s)
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许多奇迹,我们相信,才会实现……
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

林夕梦(金币+5): 额,是我打反了,是1:3 2011-11-21 12:09:41
引用回帖:
20楼: Originally posted by 林夕梦 at 2011-11-18 11:58:43:
16度,连接过夜的,大概14个小时左右了,时间该没问题吧。每次都是10ul的体系,载体和片段3:1的

载体和片段的比例是按照它们各自的浓度来定的。。。
连接之前先对载体和基因片段定量一下。。。然后再确定连接的比例!
一般情况下,片段应该多。你这明显是载体多,肯定是连接不上的。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
38楼2011-11-19 12:25:59
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longrna

新虫 (正式写手)

贴上你的连接体系及条件嘛,用哪家公司的酶?
伟大航线....
2楼2011-11-17 18:06:25
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longrna

新虫 (正式写手)

我们一般4度过夜连接,用NEB的酶
伟大航线....
3楼2011-11-17 18:10:05
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~

引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2011-11-17 18:06:25:
贴上你的连接体系及条件嘛,用哪家公司的酶?

takara的连接酶,16度过夜的
许多奇迹,我们相信,才会实现……
4楼2011-11-17 18:34:36
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