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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~

[求助] 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建

如题，基因片段3.7Kb载体7Kb，Phage载体。
连接了几次都失败了。要么转化后没有长出克隆，要么长出来也是假阳性，小提质粒后酶切片段大小不对额
大片段不好连呢，求高手指教有妙招改进么？？
(转化采用的超级感受态细胞，42度30s)
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1楼 2011-11-17 14:21:26
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2011-11-17 19:42:01:
Takara的酶不是很清楚，我们用NEB的话，一般16度一个小时或4度过夜（效率差不多）。
把载体及连接片段的比例再调整调整，我觉得只是效率问题，不可能一点都连不上的，除非连接酶有问题。

嗯，偶尔会长出几个克隆但酶切验证的片段大小总是只有2.几kb
还在继续摸索中呢
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
6楼2011-11-17 20:09:46
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longrna

新虫 (正式写手)
贴上你的连接体系及条件嘛，用哪家公司的酶？
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伟大航线....
2楼2011-11-17 18:06:25
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longrna

新虫 (正式写手)
我们一般4度过夜连接，用NEB的酶
赞一下 回复此楼
伟大航线....
3楼2011-11-17 18:10:05
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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2011-11-17 18:06:25:
贴上你的连接体系及条件嘛，用哪家公司的酶？

takara的连接酶，16度过夜的
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许多奇迹，我们相信，才会实现……
4楼2011-11-17 18:34:36
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