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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有人做过双报告基因的过表达质粒载体么？
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zhen022

新虫 (正式写手)

[求助] 有人做过双报告基因的过表达质粒载体么？ 已有1人参与

目前实验安排是将一个基因片段A，将其加载于一个质粒载体上后，E.coli扩增后用脂质体转染细胞，但是为了方面检测想做双报告基因的过表达，加上GFP/Fluc之类的东西。目前这些方面一些问题很不清楚：
1、最重要的是，目前是否有人做“红/绿荧光蛋白+荧光素酶+过表达功能基因（该处实际有三个蛋白的表达）”的质粒？要是有的话，直接借来或者买来，加上自己的基因也行啊，O(∩_∩)O哈哈~。不过发现好多公司都是只有一种报告基因，然后可以加上目的片段的。在质粒的结构中，要是表达这三种基因，是不是每种基因都有自己的启动子之类的，因此插入一个基因不是简单的数学上1+1作用？而是还得设计相应的结构。

2、查了发现，有真核细胞表达载体和原核表达载体，我这里貌似用的先要在E.coli里大量扩增，然后用于真核细胞转染，这种选择的是那种质粒载体，具体有哪一些具体的质粒啊？

菜鸟希望大家多多提供意见和建议。
再次求助：有谁有可以表达双报告基因的质粒载体？跪求实验室名字或者一些文章，国内的，O(∩_∩)O~
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1楼 2013-12-02 22:14:44
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酵母双杂交系统
双荧光报告系统 Dual luciferase report system
。。。。。
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2楼2013-12-03 08:30:26
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clcl88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhen022(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 16:51:54
我们做过类似的，以下仅供参考
1如果基因比较长应该要多加启动子，我的是报告基因和表达基因前都有加启动子。每种基因的启动子应该是有区别的，需要查相关文献。
2我们一般先在E.coli构建载体，BL21表达，大肠杆菌的表达载体和真核表达载体是有区别的，至于具体有哪些，你可以查阅文献，根据需要选择。如果你不需要大肠杆菌表达，就直接构建真核表达载体然后侵染入真核。
仅供参考哦，也不一定对哈，若有不对请大侠指正哈！
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3楼2013-12-03 08:58:53
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zhen022

新虫 (正式写手)
up up up
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4楼2013-12-04 15:55:28
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zhen022(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 16:52:02
你的问题我曾经思考过，
Promega作为Luciferase报告基因的大头，他有一套质粒叫做psiCheck，其中的psiCheck-2即在同一个骨架上有Renilla Luciferase和firefly Luciferase两个报告基因。
仔细观察这个载体的设计思路其实很简单，就是两个真核启动子，两个polyA信号，包括两个转录本。你可以自己装入你想要的基因，比如GFP、RFP之类的。
但是一个原则就是，为了防止在细菌中的同源重组，要求这些相同功能的元件不能用两次，比如psiCheck-2中用的是SV40和HSV-TK两个真核启动子，配套synthetic polyA和SV40 polyA signal。
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5楼2014-03-13 13:24:03
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋
引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-13 13:24:03
你的问题我曾经思考过，
Promega作为Luciferase报告基因的大头，他有一套质粒叫做psiCheck，其中的psiCheck-2即在同一个骨架上有Renilla Luciferase和firefly Luciferase两个报告基因。
仔细观察这个载体的设计思 ...

请教psiCheck中哪个是主质粒？为何3'utr接在HRluc后面？
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6楼2015-09-23 16:30:37
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