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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

[求助] 报告基因GFP的检测方法

各位战友，大家有没有做过GFP检测的呢？本人是构建了一个pEGFP-N1的重组质粒，里面插入了目的基因，转化酵母后，接下来要做GFP的检测和表达了。关于荧光方面，深层的原理不是很清楚，然后现在就是收集到一些可以用来检测荧光的方法，我先述说收集的方法，，也在这里做个小小总结如下：
1.GENios Plus多功能酶标仪【定量】
2.紫外分光光度计【定量】
3.流式细胞仪【定量】
4.荧光显微镜【定性】
希望有过此类经验的战友们，都能提提宝贵的意见以及自己的经验。
也为将来做这些方面的朋友们留下一份可以借鉴的帖子吧~~欢迎大家八仙过海各显其能~~期待你们的回帖~~！！
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1楼 2012-06-12 21:18:07
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
emma立夏: 金币+2, ★有帮助 2012-06-13 09:39:28
你说的转酵母不太懂，只做过转基因植物看亚细胞定位和表达模式的，直接用共聚焦荧光显微镜看的，一般不定量，不知道你做什么用的
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2楼2012-06-12 23:03:05
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zgb1982 at 2012-06-12 23:03:05
你说的转酵母不太懂，只做过转基因植物看亚细胞定位和表达模式的，直接用共聚焦荧光显微镜看的，一般不定量，不知道你做什么用的

谢谢，我是做的酵母内GFP定量表达的，就是GFP作为报告基因来检测目的基因的表达量~
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3楼2012-06-13 09:40:41
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niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-13 13:47:33
1，可用定量PCR扩目的基因或是GFP，此法比较简单   2，做western or northern，比较麻烦，但比较经典！至于你说的用荧光强度定量，本人以为可以辅助以上结果！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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Tobeornottobe,that'saproblem
4楼2012-06-13 09:48:31
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whwshzdx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

现在你的基因应该插入在多克隆点上？不知道你的基因带终止密码子不，如果带有可能悲剧，egfp在其后面是不会表达的，双基因的表达最好用Pires2-egfp质粒，ires可以起始转录。现在可能说你的基因表达了，egfp没有表达没有荧光，流式细胞仪【定量】、荧光显微镜【定性】都是筛荧光，看荧光的，这些仪器都很贵我这只有荧光显微镜。拿着你的质粒先去做转染，用荧光显微镜看下情况。
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5楼2012-06-16 23:24:24
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Kitty1988

金虫 (初入文坛)
楼主弄明白了吗，我现在开始做酵母表达GFP，用流式细胞仪，有些疑问想请教，用流式细胞仪数据用哪个？mean指的是荧光强度吗？可是对照菌（未转GFP）的也有一点数值，是忽略不计吗
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6楼2013-11-24 22:04:44
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雪人25

金虫 (小有名气)
请教一下楼主，检测酵母GFP表达前，需要对酵母进行预处理么？我的酵母对照也出现了绿色荧光，不知道怎么回事
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7楼2014-11-10 14:50:32
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