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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

[求助] 报告基因GFP的检测方法

各位战友,大家有没有做过GFP检测的呢?本人是构建了一个pEGFP-N1的重组质粒,里面插入了目的基因,转化酵母后,接下来要做GFP的检测和表达了。关于荧光方面,深层的原理不是很清楚,然后现在就是收集到一些可以用来检测荧光的方法,我先述说收集的方法,,也在这里做个小小总结如下:
1.GENios Plus多功能酶标仪【定量】
2.紫外分光光度计【定量】
3.流式细胞仪【定量】
4.荧光显微镜【定性】
希望有过此类经验的战友们,都能提提宝贵的意见以及自己的经验。
也为将来做这些方面的朋友们留下一份可以借鉴的帖子吧~~欢迎大家八仙过海各显其能~~期待你们的回帖~~!!
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
emma立夏: 金币+2, 有帮助 2012-06-13 09:39:28
你说的转酵母不太懂,只做过转基因植物看亚细胞定位和表达模式的,直接用共聚焦荧光显微镜看的,一般不定量,不知道你做什么用的
2楼2012-06-12 23:03:05
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zgb1982 at 2012-06-12 23:03:05
你说的转酵母不太懂,只做过转基因植物看亚细胞定位和表达模式的,直接用共聚焦荧光显微镜看的,一般不定量,不知道你做什么用的

谢谢,我是做的酵母内GFP定量表达的,就是GFP作为报告基因来检测目的基因的表达量~
3楼2012-06-13 09:40:41
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niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-13 13:47:33
1,可用定量PCR扩目的基因或是GFP,此法比较简单   2,做western or northern,比较麻烦,但比较经典!至于你说的用荧光强度定量,本人以为可以辅助以上结果!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
Tobeornottobe,that'saproblem
4楼2012-06-13 09:48:31
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whwshzdx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

现在你的基因应该插入在多克隆点上?不知道你的基因带终止密码子不,如果带有可能悲剧,egfp在其后面是不会表达的,双基因的表达最好用Pires2-egfp质粒,ires可以起始转录。现在可能说你的基因表达了,egfp没有表达没有荧光,流式细胞仪【定量】、荧光显微镜【定性】都是筛荧光,看荧光的,这些仪器都很贵我这只有荧光显微镜。拿着你的质粒先去做转染,用荧光显微镜看下情况。
5楼2012-06-16 23:24:24
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Kitty1988

金虫 (初入文坛)

楼主弄明白了吗,我现在开始做酵母表达GFP,用流式细胞仪,有些疑问想请教,用流式细胞仪数据用哪个?mean指的是荧光强度吗?可是对照菌(未转GFP)的也有一点数值,是忽略不计吗
6楼2013-11-24 22:04:44
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雪人25

金虫 (小有名气)

请教一下楼主,检测酵母GFP表达前,需要对酵母进行预处理么?我的酵母对照也出现了绿色荧光,不知道怎么回事
7楼2014-11-10 14:50:32
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