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baisuilan

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】双荧光素酶报告系统出现几个问题，求解答，谢谢。

我使用Hela细胞系，利用siRNA和pcDNA4表达质粒，研究抑制或过表达目的基因A对CBF启动子的作用。利用脂质体lipo2000共转染，报告基因质粒是pGL2-CBF-Luc，并且用含突变CBF启动子的报告质粒做阴性对照报告质粒，内参是pRL-TK海肾荧光素酶表达质粒。
过表达A基因之后，无论正常报告质粒还是突变体报告质粒，萤火虫荧光素酶的强度都降低（比转空质粒的对照低50%左右），而内参海肾荧光素酶强度也同样变低。请问这是何故？
突变体的报告质粒应该不受目的基因A的影响。计算fLuc/rLuc比值后发现，正常报告基因质粒的相对表达量比对照高30%左右，突变体报告基因相对表达量则没变化。
请问，目的基因A对于CBF启动子起抑制作用还是增强作用？
之前使用293T细胞系，过表达目的基因A之后fLuc也明显降低，但rLuc有时候明显降低，有时候不变。
请问我的实验数据可信吗？我是否需要改变实验条件？
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1楼 2010-12-12 19:43:12
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右岸晴雨

铜虫 (初入文坛)
最近我想克隆荧光素酶基因，可以向您要些质粒作为模版用吗
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2楼2010-12-21 11:00:57
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Frank王

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by baisuilan at 2010-12-12 19:43:12:
我使用Hela细胞系，利用siRNA和pcDNA4表达质粒，研究抑制或过表达目的基因A对CBF启动子的作用。利用脂质体lipo2000共转染，报告基因质粒是pGL2-CBF-Luc，并且用含突变CBF启动子的报告质粒做阴性对照报告质粒，内参 ...

请问有PRL-TK和pMIR-REPORT™
β-gal Control Plasmid载体的序列吗？
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3楼2011-12-30 21:29:44
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here0009

银虫 (著名写手)
★
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楼主你好，我也出现了这个问题，不过我的是萤火虫和海参的荧光值都怎大了，我也在苦恼怎么办呢。想试一下调整质粒量的比例。你的问题解决了吗
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4楼2013-03-18 11:16:59
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主你的问题解决了吗？我也是用海肾荧光素酶作的内参，萤火虫荧光素酶变了，可是海肾荧光素酶也变了。
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5楼2016-03-26 16:03:45
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