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林夕梦

木虫 (文坛精英)

珊瑚岛碧落堂主~~

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[求助] 3.7Kb片段基因与7Kb载体的质粒构建

如题，基因片段3.7Kb载体7Kb，Phage载体。
连接了几次都失败了。要么转化后没有长出克隆，要么长出来也是假阳性，小提质粒后酶切片段大小不对额

大片段不好连呢，求高手指教有妙招改进么？？

(转化采用的超级感受态细胞，42度30s)

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许多奇迹，我们相信，才会实现……

1楼 2011-11-17 14:21:26

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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
林夕梦(金币+5): 听你这么说，顿时又有了信心。不过细节的应该没啥问题的，下次在调节一下连接体系吧 2011-11-17 20:56:54
西瓜(金币+2): Good！ 2011-11-17 21:37:58
wanhscn(金币+2, MolEPI+1): 是的!鼓励应助回帖!PS:我也连过10K的,没有那么难!希望老兄继续踊跃回帖! 破格授予专家指数一枚 ! 2011-11-19 18:53:58

这个片段3.7Kb，载体7Kb连接应该是很好连接地，我们超过10kb的连接经常做也没有多大的问题，只是连接效率比小片段低一些。
至于连接要注意实验中的一些小细节问题：酶切割胶回收纯化是否干净？连接体系比例合不合适？感受态细胞好不好？等等啦！
Takara的酶和NEB的酶都很好用的！祝实验顺利！