应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
241/3返回列表123下一页
查看: 4012  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR最后一步做不出来，求救！！！

做3片段的融合PCR，左翼片段、抗性片段、右翼片段分别是800、2000、800bp，分别割胶回收后的浓度大约是70、120、70纳克/微升。
按摩尔比1:3:1的比例进行融合，第一个步10个循环，94度 30秒；57度 30秒；72度 4分钟，第一步用的是Pfu酶。
第二步取第一步的产物1微升作为模板，两侧F1、R2各2微升，5微升buffer，1微升dNTP(10mM)，0.5微升Ex taq.   第二步与第一步的反应温度一样，28个循环。

最后跑出来的条带很混乱，我的目的条带应该在3800左右，可是跑胶得到的条带好像被分解了一样，全都在1000左右。
求助各位达人，这是在哪里出了问题？



上图右向左数第三道就是我说的融合后产物跑胶结果。
融合PCR最后一步做不出来，求救！！！
预融合产物稀释1、10、100倍融合 2013-08-20 10 小时 02 分钟.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-09-26 19:50:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:20:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-26 20:28:15
现在有个情况，就是我可以融合上左翼片段和抗性基因、右翼片段和抗性基因。
今天试了一下用这两组片段进行1：1的融合，还是不行啊。

可以尝试用T4 DNA聚合酶或T5 DNA外切酶在没有dNTP的情况下处理后在聚合，连接，具体搜索LIC克隆和Gibson 。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
10楼2013-09-27 00:01:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:41:16
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 20:41:19
我们的经验：
1. 融合时做退火温度梯度，退货时间可延长至长达3-5 min（原理我也不清楚）；
2. 最后一次pcr时，不用原来扩侧翼片段的那两条最外侧引物，而是新设计一对位置略靠近内部一点的巢式引物。这个非常管用，但你的情况这样做的话可能就需要重新扩侧翼片段了。
3. 扩片段、融合用Pfu，最后一次pcr可以用高效的Taq类酶。
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2013-09-28 05:08:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-26 20:41:18
建议提高退火温度到59.
我做融合PCR不分第一第二步的, 我会把所有片段和两端的引物加好然后跑一次PCR(当然用pfu). 楼主可以参考.
赞一下 回复此楼
2楼2013-09-26 19:59:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-09-26 19:59:06
建议提高退火温度到59.
我做融合PCR不分第一第二步的, 我会把所有片段和两端的引物加好然后跑一次PCR(当然用pfu). 楼主可以参考.

请问你也是融合3片段吗？
用PFU酶的话延伸的时间那么长是不是需要加大dNTP的量呢？
赞一下 回复此楼
3楼2013-09-26 20:04:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 17:19:44
中间片段用太多了吧，减少为现在的1/10就可以了。第二步的模板可以做个梯度，现在的可能还是多了。
赞一下 回复此楼
为什么
4楼2013-09-26 20:13:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2013-09-26 20:13:07
中间片段用太多了吧，减少为现在的1/10就可以了。第二步的模板可以做个梯度，现在的可能还是多了。

楼主说的是按摩尔比加入的，为什么大片段的要少加呢？？
赞一下 回复此楼
5楼2013-09-26 20:23:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
现在有个情况，就是我可以融合上左翼片段和抗性基因、右翼片段和抗性基因。
今天试了一下用这两组片段进行1：1的融合，还是不行啊。
赞一下 回复此楼
6楼2013-09-26 20:28:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-26 20:28:15
现在有个情况，就是我可以融合上左翼片段和抗性基因、右翼片段和抗性基因。
今天试了一下用这两组片段进行1：1的融合，还是不行啊。

密切关注中，我已经做了两个月，至今无果。。。
赞一下 回复此楼
7楼2013-09-26 20:29:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-09-26 20:29:21
密切关注中，我已经做了两个月，至今无果。。。...

握手……
我也是做了2个月了，目前的进度最远就是只能其中两个片段融合上，三个片段很难融合，能问问你是遇到什么问题吗？
赞一下 回复此楼
8楼2013-09-26 20:41:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-09-26 20:41:22
握手……
我也是做了2个月了，目前的进度最远就是只能其中两个片段融合上，三个片段很难融合，能问问你是遇到什么问题吗？...

同样的问题，我也是到你的这一步，然后再融合的时候就一直弥散，刚开始我觉得可能是我的引物纯化方式有问题，后来就换了HPLC，但是还是没有成功，而且目前的问题还多了一个，那就是以两两融合的片段为模板，无法得到扩增。所以现在也在找方法。
赞一下 回复此楼
9楼2013-09-26 20:51:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 猫di阁楼 的主题更新
241/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +6 启萌科技 2026-08-12 21/1050 2026-08-14 19:48 by 启萌科技
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-14 18:36 by 正能量1斤
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭