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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 融合PCR请帮忙看看图片吧
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)

[求助] 融合PCR请帮忙看看图片吧 已有2人参与

我两个条带 一个是1680bp；另一个是2550bp ,然后融合，第二轮PCR不加引物，其他同常规PCR；用的是LAtaq酶。融合之后既有融合片段，又有原始的两条片段！可是当我进行完第三轮pcr之后（此时加入的引物为2550bp上游引物 和 1680bp的下游引物），跑胶发现第二轮pcr跑胶图片中原始条带2550bp不怎么亮的带，第三轮却是出奇的亮啊！而融合片段却不怎么亮，求解啊？（1KBmarker 和 Hind111）融合PCR请帮忙看看图片吧
第二轮pcr图片
融合PCR请帮忙看看图片吧-1
第三轮PCR图片

[ Last edited by jiaoxiayoulu on 2014-3-5 at 17:14 ]
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1楼 2014-03-05 17:10:27
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jiaoxiayoulu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:10:11
第二轮PCR不加引物，其他同常规PCR，此时循环数设为7-8，然后加引物，扩增。
如需大量扩增，以第二轮的作为模板（1ul），进行扩增。可稍微提高下退火温度。
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2楼2014-03-05 17:14:50
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-05 17:14:50
第二轮PCR不加引物，其他同常规PCR，此时循环数设为7-8，然后加引物，扩增。
如需大量扩增，以第二轮的作为模板（1ul），进行扩增。可稍微提高下退火温度。

我第一轮没用高保真酶，用的普通taq酶！第二轮我设置了20个循环，目的是让他尽可能多的产生融合片段！第三轮PCR时我以第二轮产物（没做胶回收，也没有纯化）为模板，左边条带为取了10ul二轮产物，右边条带我是取了5ul二轮产物为模板。我想知道，为什么二轮PCR小条带很亮，而三轮PCR大条带却很亮？？？？？？？
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3楼2014-03-05 18:08:25
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
内容已删除
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4楼2014-03-05 19:43:14
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三蛰

铜虫 (小有名气)
Gibson？
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我不会！
5楼2014-03-05 20:16:20
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-03-05 20:16:20
Gibson？

????
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6楼2014-03-05 20:29:03
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jiaoxiayoulu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:10:23
你这两次加的样量一样吗？再一个你把两次结果放一块跑跑。再一个你第三次PCR模板不要加太多，我们一般稀释一百倍再跑。
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hehe
7楼2014-03-05 21:01:26
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