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pigskin新虫 (初入文坛)
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定量PCR融解曲线问题
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所有数据都进入平台期。 第一张图：Jurkat cell 原模板25ul体系。后面92度有个峰。而且很高的杂峰。 第二张图：Jurkat cell 模板稀释三倍。七十多度二聚体减少。后面92度还是有起峰。 第三张图：U936 cell 模板稀释三倍。后面92度没起峰。 第四张图：Jurkat cell 原模板GAPDH。 第五张图：Jurkat cell 普通PCR。 我是用SYBR green做的。在Jurkat cell中，起了杂峰，比主峰还高，以为引物特异性不好。可是，在U937 cell中，就没有出现这个杂峰。普通PCR也就一条带。定量后没有跑胶。现在我是重新设计引物还是应该怎么办？请各位指导下。万分感谢。      |
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【答案】应助回帖
pigskin(金币+5): 谢谢。我也想还是换引物比较好。 2011-05-10 11:21:42
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:34:54
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:34:54
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我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖： 1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。 2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。 这种情况下我个人建议还是换引物。 3.NTC没做？不加模板的。在凝胶和荧光下都要做。这是必须的。 4.另外我想知道扩增曲线怎么样？正常吗？ 5.凝胶图不清晰，建议用高浓度的胶。我一般不称，就是琼脂糖多加点，这样分辨率会高些。 6.个人习惯问题，我建议引物不好时就不要用了。设计没那么难。 |
2楼2011-05-10 11:19:39
pigskin
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3楼2011-05-10 11:22:30
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4楼2011-05-10 11:25:57
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