24小时热门版块排行榜

返回列表

本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

pigskin

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 3823.5
红花: 1
帖子: 46
在线: 12.1小时
虫号: 1205687
注册: 2011-02-18
性别: MM
专业: 神经生物学

[求助] 定量PCR融解曲线问题

所有数据都进入平台期。
第一张图：Jurkat cell 原模板25ul体系。后面92度有个峰。而且很高的杂峰。
第二张图：Jurkat cell 模板稀释三倍。七十多度二聚体减少。后面92度还是有起峰。
第三张图：U936 cell 模板稀释三倍。后面92度没起峰。
第四张图：Jurkat cell 原模板GAPDH。
第五张图：Jurkat cell 普通PCR。

我是用SYBR green做的。在Jurkat cell中，起了杂峰，比主峰还高，以为引物特异性不好。可是，在U937 cell中，就没有出现这个杂峰。普通PCR也就一条带。定量后没有跑胶。现在我是重新设计引物还是应该怎么办？请各位指导下。万分感谢。

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

荧光定量扩增曲线与融解曲线分析已经有9人回复
RT-PCR扩增图和溶解曲线跑成这样已经有12人回复
求高手解救荧光定量的问题已经有6人回复
帮我看看这个溶解qPCR曲线已经有6人回复
抽病毒DNA做荧光定量，阴性老是不成立，怎么办已经有6人回复
荧光定量怎么成了这样已经有26人回复
向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题已经有9人回复
【求助】几个关于实时定量PCR的问题已经有12人回复
【求助/交流】内参照条带分子量大小与预期不符已经有4人回复
【求助/交流】荧光定量融解曲线怪异已经有6人回复
【求助/交流】求助关于实时定量PCR 已经有8人回复
【求助/交流】今天做的Rea Time PCR怎么看不到融解曲线？是不是前面设置出现了问题？已经有8人回复
【求助/交流】PCR新手求助分析溶解曲线已经有5人回复
【专题】real time pcr目的基因的融解曲线不明白已经有8人回复

1楼2011-05-10 10:52:38

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

pigskin

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 3823.5
红花: 1
帖子: 46
在线: 12.1小时
虫号: 1205687
注册: 2011-02-18
性别: MM
专业: 神经生物学

引用回帖:

Originally posted by adslye at 2011-05-10 11:19:39:
我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖：
1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。
2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。这种情况下我个人建议还是换引物。
3.NTC没做？不加 ...

本身这个引物特异性不好。可是。为什么细胞系不同。后面那个杂峰就没有。。这是我疑惑的地方。。

赞一下

回复此楼

4楼2011-05-10 11:25:57

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 6 个回答

adslye

银虫 (正式写手)

BioEPI: 10
应助: 6 (幼儿园)
贵宾: 0.244
金币: 364.9
散金: 766
红花: 6
帖子: 514
在线: 119.5小时
虫号: 845336
注册: 2009-09-11
性别: GG
专业: 流行病学方法与卫生统计

【答案】应助回帖

pigskin(金币+5): 谢谢。我也想还是换引物比较好。 2011-05-10 11:21:42
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:34:54

我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖：
1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。
2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。这种情况下我个人建议还是换引物。
3.NTC没做？不加模板的。在凝胶和荧光下都要做。这是必须的。
4.另外我想知道扩增曲线怎么样？正常吗？
5.凝胶图不清晰，建议用高浓度的胶。我一般不称，就是琼脂糖多加点，这样分辨率会高些。
6.个人习惯问题，我建议引物不好时就不要用了。设计没那么难。

赞一下(1人)

回复此楼

2楼2011-05-10 11:19:39

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖