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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助关于实时定量PCR
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】求助关于实时定量PCR

各位兄弟姐妹，
我做某miRNA的定量PCR，前段时间效果一直很好。不知为什么这两次做的融解曲线的峰（纵坐标为荧光值）都要比原来低很多，原来的峰基本上和内参U6的峰一样高，但现在基本上只有之前的一半。请教这是怎么回事？所有的条件都是一样的。
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1楼 2011-02-21 20:42:46
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sutao1979

木虫 (著名写手)
★
xuehu2008(金币+1):谢谢参与
xuehu2008(金币+2): 2011-02-22 10:49:33

检查一下fluorescent dye是否有问题，这些都是要避光的
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3楼2011-02-22 02:05:25
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

dye一直是避光保存的，没有什么变化啊。
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4楼2011-02-22 10:50:11
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
xuehu2008(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-22 14:51:49
xuehu2008(金币+2): 2011-02-22 14:58:26

染料问题，买的试剂盒？
不过不影响结果
结果很好
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5楼2011-02-22 12:24:29
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

是promega的试剂盒，不过若是染料问题，那U6为什么正常？
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6楼2011-02-22 14:59:14
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励 2011-02-22 18:22:14
引用回帖:
Originally posted by xuehu2008 at 2011-02-22 06:59:14:
是promega的试剂盒，不过若是染料问题，那U6为什么正常？

如果这是一批的话，还要看你的扩增曲线，把图片发上来看看

荧光值降低可能是试剂盒的扩增效率降低，这样对于高丰度的模板影响不大，而对于低丰度的模板则会影响较大

或者模板有降解，原理同上



还有，比如你的引物加少了，自然就荧光值低了，当然，我想这种可能性应该不大


总之，荧光值降低表示你的染料出了问题或者终产物减少

如你所述，那就应该是后者
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7楼2011-02-22 16:28:09
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

附图是扩增曲线，也可以看出来峰要低得多。？？？
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8楼2011-02-22 17:13:34
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
xuehu2008(金币+5): 2011-02-23 09:35:06
xuehu2008(金币+5): 2011-02-25 15:09:36
ct值升高
可见是mix效率降低，或者模板有降解
从这两方面着手就行了
用新买的mix试一下，还不行就是模板出现了降解了
首先怀疑mix
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9楼2011-02-23 08:31:05
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heshiqing1682楼
2011-02-21 20:49   回复  
xuehu2008(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币-1): 注意学习版规，求助帖禁止纯表情回复~~~ 2011-02-22 16:27:16
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