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pigskin

新虫 (初入文坛)

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[求助] 定量PCR融解曲线问题

所有数据都进入平台期。
第一张图：Jurkat cell 原模板25ul体系。后面92度有个峰。而且很高的杂峰。
第二张图：Jurkat cell 模板稀释三倍。七十多度二聚体减少。后面92度还是有起峰。
第三张图：U936 cell 模板稀释三倍。后面92度没起峰。
第四张图：Jurkat cell 原模板GAPDH。
第五张图：Jurkat cell 普通PCR。

我是用SYBR green做的。在Jurkat cell中，起了杂峰，比主峰还高，以为引物特异性不好。可是，在U937 cell中，就没有出现这个杂峰。普通PCR也就一条带。定量后没有跑胶。现在我是重新设计引物还是应该怎么办？请各位指导下。万分感谢。

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1楼2011-05-10 10:52:38

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pigskin

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引用回帖:

Originally posted by adslye at 2011-05-10 11:19:39:
我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖：
1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。
2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。这种情况下我个人建议还是换引物。
3.NTC没做？不加 ...

NTC做了。。有引物二聚体。扩增曲线都还不错。。都达到平台期。。

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3楼2011-05-10 11:22:30

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adslye

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【答案】应助回帖

pigskin(金币+5): 谢谢。我也想还是换引物比较好。 2011-05-10 11:21:42
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:34:54

我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖：
1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。
2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。这种情况下我个人建议还是换引物。
3.NTC没做？不加模板的。在凝胶和荧光下都要做。这是必须的。
4.另外我想知道扩增曲线怎么样？正常吗？
5.凝胶图不清晰，建议用高浓度的胶。我一般不称，就是琼脂糖多加点，这样分辨率会高些。
6.个人习惯问题，我建议引物不好时就不要用了。设计没那么难。

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2楼2011-05-10 11:19:39

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