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waldenpond

金虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】内参照条带分子量大小与预期不符

我PCR后跑胶,目的产物的条带都很正常,但是内参照β-actin的条带却不正常。我用的β-actin分子量是330bp,但是跑出来的条带却还不到300bp,也就280-290左右。
请教大家这是为什么啊?
难道是我合成的引物有问题?还是我跑胶有问题,我跑了两次了啊,结果都是这样。
PS:这是我在NCBI上查到的我的β-actin信息,大侠们帮忙看一下对不对哈。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/sts.cgi?uid=271688
UniSTS:271688 Links

PMC18465P1
Bos taurus locus ACTB
Mus musculus chromosome 5, locus Actb
Rattus norvegicus locus Actb

Found by e-PCR in sequences from Bos taurus, Cricetinae gen. sp., Cryptosporidium muris, Mus musculus, Plasmodium yoelii, Rattus norvegicus and Zea mays.

Primer Information


Forward primer: CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA
Reverse primer: TTGGCCTTAGGGTTCAGAGGGG
PCR product size: 330 (bp), Mus musculus
330 (bp), Rattus norvegicus


[ Last edited by waldenpond on 2011-4-6 at 17:11 ]
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
waldenpond(金币+3): 2011-04-06 17:15:29
waldenpond(金币+3): 2011-04-06 17:16:06
模板是cDNA吗?如果这样,有可能是设计引物时参照的是基因组DNA,中间有内含子,所以拿cDNA扩增时就比预期短了。纯属猜测。
2楼2011-04-06 17:11:03
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waldenpond

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 17:11:03:
模板是cDNA吗?如果这样,有可能是设计引物时参照的是基因组DNA,中间有内含子,所以拿cDNA扩增时就比预期短了。纯属猜测。

有可能哈,我直接在NCBI上找的现成引物,也没注意是cDNA还是DNA。大侠高见,能不能帮忙再给看一下。
如果我设计引物时参照的是基因组DNA,那现在我做出来的结果还能不能用哈?还是需要另外设计引物?
3楼2011-04-06 17:14:22
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★ ★
waldenpond(金币+4): 2011-04-06 18:23:24
1949stone(金币+2): 鼓励 学习 2011-04-06 18:30:59
引用回帖:
Originally posted by waldenpond at 2011-04-06 17:14:22:
有可能哈,我直接在NCBI上找的现成引物,也没注意是cDNA还是DNA。大侠高见,能不能帮忙再给看一下。
如果我设计引物时参照的是基因组DNA,那现在我做出来的结果还能不能用哈?还是需要另外设计引物?

你那链接我没看懂……
我觉得是能用的。
你这PCR是做啥的?定量吗?
如果是半定量(跑胶直接比较条带亮度),那只要你的内参条带特异(只有一条带),且不同样品的内参条带亮度差不多,那就可以用。
如果是荧光定量PCR(实时定量PCR,real-time PCR),除了看跑胶条带是否特异,还得再看一看内参的融解曲线,只有一个特异的峰的话就没问题了。
4楼2011-04-06 17:42:03
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waldenpond

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 17:42:03:
你那链接我没看懂……
我觉得是能用的。
你这PCR是做啥的?定量吗?
如果是半定量(跑胶直接比较条带亮度),那只要你的内参条带特异(只有一条带),且不同样品的内参条带亮度差不多,那就可以用。 ...

好的,谢谢!
5楼2011-04-06 18:23:18
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