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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】内参照条带分子量大小与预期不符
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waldenpond

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】内参照条带分子量大小与预期不符

我PCR后跑胶，目的产物的条带都很正常，但是内参照β-actin的条带却不正常。我用的β-actin分子量是330bp，但是跑出来的条带却还不到300bp,也就280-290左右。
请教大家这是为什么啊？
难道是我合成的引物有问题？还是我跑胶有问题，我跑了两次了啊，结果都是这样。
PS：这是我在NCBI上查到的我的β-actin信息，大侠们帮忙看一下对不对哈。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/sts.cgi?uid=271688
UniSTS:271688 Links

PMC18465P1
Bos taurus locus ACTB
Mus musculus chromosome 5, locus Actb
Rattus norvegicus locus Actb

Found by e-PCR in sequences from Bos taurus, Cricetinae gen. sp., Cryptosporidium muris, Mus musculus, Plasmodium yoelii, Rattus norvegicus and Zea mays.

Primer Information


Forward primer: CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA
Reverse primer: TTGGCCTTAGGGTTCAGAGGGG
PCR product size: 330 (bp), Mus musculus
330 (bp), Rattus norvegicus

[ Last edited by waldenpond on 2011-4-6 at 17:11 ]
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1楼 2011-04-06 17:05:45
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
waldenpond(金币+4): 2011-04-06 18:23:24
1949stone(金币+2): 鼓励 学习 2011-04-06 18:30:59
引用回帖:
Originally posted by waldenpond at 2011-04-06 17:14:22:
有可能哈，我直接在NCBI上找的现成引物，也没注意是cDNA还是DNA。大侠高见，能不能帮忙再给看一下。
如果我设计引物时参照的是基因组DNA，那现在我做出来的结果还能不能用哈？还是需要另外设计引物？

你那链接我没看懂……
我觉得是能用的。
你这PCR是做啥的？定量吗？
如果是半定量（跑胶直接比较条带亮度），那只要你的内参条带特异（只有一条带），且不同样品的内参条带亮度差不多，那就可以用。
如果是荧光定量PCR（实时定量PCR，real-time PCR），除了看跑胶条带是否特异，还得再看一看内参的融解曲线，只有一个特异的峰的话就没问题了。
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4楼2011-04-06 17:42:03
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
waldenpond(金币+3): 2011-04-06 17:15:29
waldenpond(金币+3): 2011-04-06 17:16:06
模板是cDNA吗？如果这样，有可能是设计引物时参照的是基因组DNA，中间有内含子，所以拿cDNA扩增时就比预期短了。纯属猜测。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-04-06 17:11:03
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waldenpond

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 17:11:03:
模板是cDNA吗？如果这样，有可能是设计引物时参照的是基因组DNA，中间有内含子，所以拿cDNA扩增时就比预期短了。纯属猜测。

有可能哈，我直接在NCBI上找的现成引物，也没注意是cDNA还是DNA。大侠高见，能不能帮忙再给看一下。
如果我设计引物时参照的是基因组DNA，那现在我做出来的结果还能不能用哈？还是需要另外设计引物？
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3楼2011-04-06 17:14:22
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waldenpond

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-06 17:42:03:
你那链接我没看懂……
我觉得是能用的。
你这PCR是做啥的？定量吗？
如果是半定量（跑胶直接比较条带亮度），那只要你的内参条带特异（只有一条带），且不同样品的内参条带亮度差不多，那就可以用。 ...

好的，谢谢！
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5楼2011-04-06 18:23:18
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