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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 定量PCR融解曲线问题
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pigskin

新虫 (初入文坛)

[求助] 定量PCR融解曲线问题

所有数据都进入平台期。
第一张图：Jurkat cell 原模板25ul体系。后面92度有个峰。而且很高的杂峰。
第二张图：Jurkat cell 模板稀释三倍。七十多度二聚体减少。后面92度还是有起峰。
第三张图：U936 cell 模板稀释三倍。后面92度没起峰。
第四张图：Jurkat cell 原模板GAPDH。
第五张图：Jurkat cell 普通PCR。

我是用SYBR green做的。在Jurkat cell中，起了杂峰，比主峰还高，以为引物特异性不好。可是，在U937 cell中，就没有出现这个杂峰。普通PCR也就一条带。定量后没有跑胶。现在我是重新设计引物还是应该怎么办？请各位指导下。万分感谢。
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1楼2011-05-10 10:52:38
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

pigskin(金币+5): 谢谢。我也想还是换引物比较好。 2011-05-10 11:21:42
silicare(EPI+1): 2011-05-10 13:34:54
我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖：
1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。
2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。 这种情况下我个人建议还是换引物。
3.NTC没做？不加模板的。在凝胶和荧光下都要做。这是必须的。
4.另外我想知道扩增曲线怎么样？正常吗？
5.凝胶图不清晰，建议用高浓度的胶。我一般不称，就是琼脂糖多加点，这样分辨率会高些。
6.个人习惯问题，我建议引物不好时就不要用了。设计没那么难。
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2楼2011-05-10 11:19:39
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pigskin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-05-10 11:19:39:
我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖：
1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。
2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。 这种情况下我个人建议还是换引物。
3.NTC没做？不加 ...

NTC做了。。有引物二聚体。扩增曲线都还不错。。都达到平台期。。
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3楼2011-05-10 11:22:30
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pigskin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-05-10 11:19:39:
我做过点荧光，以下几点建议，欢迎拍砖：
1.定量出现杂峰后一定要跑胶看看。看下实际条带情况。
2.我觉得你引物特异性不好，不只有二聚体还有非特异性产物。 这种情况下我个人建议还是换引物。
3.NTC没做？不加 ...

本身这个引物特异性不好。可是。为什么细胞系不同。后面那个杂峰就没有。。这是我疑惑的地方。。
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4楼2011-05-10 11:25:57
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢交流 2011-05-11 18:31:15
引用回帖:
Originally posted by pigskin at 2011-05-10 11:25:57:
本身这个引物特异性不好。可是。为什么细胞系不同。后面那个杂峰就没有。。这是我疑惑的地方。。

微观的东西很难讲，比如另一个细胞的序列具有和你引物结合的位点。
这个没必要纠结，荧光定量才是你的目的，不要在小方法上浪费太多时间。换个引物就完事了。
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5楼2011-05-10 20:06:58
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by adslye at 2011-05-10 20:06:58
微观的东西很难讲，比如另一个细胞的序列具有和你引物结合的位点。
这个没必要纠结，荧光定量才是你的目的，不要在小方法上浪费太多时间。换个引物就完事了。...

大侠  你好 我做了的扩增曲线出来了  但是溶解曲线没有 这是什么原因呢？请问
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生命不息奋斗不止
6楼2014-05-28 17:14:36
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