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1058744774

新虫 (初入文坛)

[求助] 急！各位帮忙看看，PCR后跑的琼脂糖凝胶电泳图，条带不清晰原因是什么？

各位大侠好，本人刚开始做PCR,帮忙分析一下电泳条带不清晰的原因吧。
图中从左到右是同一DNA模板，不同引物，同一RCR条件的产物
出现这种情况什么原因呢？说明模板有问题？还是需要改变PCR条件，或者增加镁离子浓度？
急！各位帮忙看看，PCR后跑的琼脂糖凝胶电泳图，条带不清晰原因是什么？
DNA.jpg
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1楼 2013-07-30 22:50:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 很有道理哈 2013-07-31 14:04:30
引用回帖:
7楼: Originally posted by 1058744774 at 2013-07-31 09:51:46
是gDNA.退火温度是36℃，40个循环。优化退火温度是根据这个公式吗？Tm=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)...

36°C是不是太低了？会有很多非特异条带的。通常PCR的退火温度在50-65°C。引物合成单上一般有Tm值，你根据Tm降低2-3°C试。如果有条件的话，最好能做个退火温度梯度。
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10楼2013-07-31 10:28:25
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普通回帖

TPR有点叼

金虫 (正式写手)
★
myprayer: 金币+1, 分子生物期待你得精彩！ 2013-07-30 23:16:33
路过。听说不亮，不清晰也有没P好的原因。。。。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-07-30 22:59:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是用gDNA为模板？引物的退火温度优化了没有？
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3楼2013-07-30 23:20:50
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rth1983

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-07-31 14:03:52
你是在筛选引物吗？有的时候一些引物扩出来就这个样子，需要重新设计。不过如果你能确定这个引物扩增你的样品可以获得清晰的条带，可以优化一下PCR条件。镁离子浓度啥的到不用改，体系就用你们实验室的成熟的体系。可以优化下退火温度，时间等。不过有的时候模板不好也会这样。。
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4楼2013-07-31 03:21:28
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qming82

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
5楼2013-07-31 09:22:58
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1058744774

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by rth1983 at 2013-07-31 03:21:28
你是在筛选引物吗？有的时候一些引物扩出来就这个样子，需要重新设计。不过如果你能确定这个引物扩增你的样品可以获得清晰的条带，可以优化一下PCR条件。镁离子浓度啥的到不用改，体系就用你们实验室的成熟的体系。 ...

我现在最想确定是不是模板的问题，如果是模板有问题那么第五个引物的条带为什么是清晰的呢，谢谢指教。
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6楼2013-07-31 09:42:30
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1058744774

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-30 23:20:50
是用gDNA为模板？引物的退火温度优化了没有？

是gDNA.退火温度是36℃，40个循环。优化退火温度是根据这个公式吗？Tm=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)
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7楼2013-07-31 09:51:46
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1058744774

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by qming82 at 2013-07-31 09:22:58
如果是自己设计的引物，需要事先做一个温度梯度PCR，找到最佳的退火温度，如果是从文献中参考的引物，一般就不用优化退火温度；如果是复杂模板，可以考虑在体系添加

请问添加什么？是不是用DNA模板跑电泳只出现一条亮带就能证明DNA纯度高？
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8楼2013-07-31 10:00:15
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-31 14:04:11
如果都是统一模板的话，你的模板是没有问题的，至于PCR条件，一般我们都不优化PCR体系，主要是退火温度的问题，你36 ° 实在有点低，而且我们设计引物的时候一般都是60°左右，Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
9楼2013-07-31 10:02:44
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