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1058744774

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-31 10:28:25
36°C是不是太低了?会有很多非特异条带的。通常PCR的退火温度在50-65°C。引物合成单上一般有Tm值,你根据Tm降低2-3°C试。如果有条件的话,最好能做个退火温度梯度。...

谢谢!我用的是北京鼎国昌盛合成的引物,引物合成单上有两个Tm值,分别是Tm1和Tm5,这两个值都在35℃-20℃之间;GC%为60%。
请问我的退火温度可以设到50℃吗?
11楼2013-07-31 11:47:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1058744774: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-31 15:13:06
引用回帖:
11楼: Originally posted by 1058744774 at 2013-07-31 11:47:58
谢谢!我用的是北京鼎国昌盛合成的引物,引物合成单上有两个Tm值,分别是Tm1和Tm5,这两个值都在35℃-20℃之间;GC%为60%。
请问我的退火温度可以设到50℃吗?...

这好像不行。可能是你设计的引物太短了,一般情况下至少要有16-20个配对碱基才能保证引物的特异性。
12楼2013-07-31 13:07:37
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rth1983

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 1058744774 at 2013-07-31 09:42:30
我现在最想确定是不是模板的问题,如果是模板有问题那么第五个引物的条带为什么是清晰的呢,谢谢指教。...

统一模版的话,应该没有问题,36度的退火温度太低了。。
13楼2013-07-31 13:19:32
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1058744774

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-31 13:07:37
这好像不行。可能是你设计的引物太短了,一般情况下至少要有16-20个配对碱基才能保证引物的特异性。...

哦,这样呀,万分感谢!
14楼2013-07-31 15:12:00
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hao327791557

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉模板应该没有问题,你的引物设计的不好吧,有好多二聚体的存在,建议你做PCR,用rTAP的或者LA的mix,这样能够排除加样等方面的原因。
不懈
15楼2013-07-31 23:28:52
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笨熊zhou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
退火温度或者延伸时间吧?
每天对着镜子开心一笑
16楼2013-08-01 17:08:20
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
退火温度太低,提高退货温度。PCR条件和程序及片段大学写清楚,才好分析。
17楼2013-08-02 09:05:25
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