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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急！各位帮忙看看，PCR后跑的琼脂糖凝胶电泳图，条带不清晰原因是什么？
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1058744774

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-31 10:28:25
36°C是不是太低了？会有很多非特异条带的。通常PCR的退火温度在50-65°C。引物合成单上一般有Tm值，你根据Tm降低2-3°C试。如果有条件的话，最好能做个退火温度梯度。...

谢谢！我用的是北京鼎国昌盛合成的引物，引物合成单上有两个Tm值,分别是Tm1和Tm5，这两个值都在35℃-20℃之间；GC%为60%。
请问我的退火温度可以设到50℃吗？
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11楼2013-07-31 11:47:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1058744774: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-31 15:13:06
引用回帖:
11楼: Originally posted by 1058744774 at 2013-07-31 11:47:58
谢谢！我用的是北京鼎国昌盛合成的引物，引物合成单上有两个Tm值,分别是Tm1和Tm5，这两个值都在35℃-20℃之间；GC%为60%。
请问我的退火温度可以设到50℃吗？...

这好像不行。可能是你设计的引物太短了，一般情况下至少要有16-20个配对碱基才能保证引物的特异性。
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12楼2013-07-31 13:07:37
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rth1983

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 1058744774 at 2013-07-31 09:42:30
我现在最想确定是不是模板的问题，如果是模板有问题那么第五个引物的条带为什么是清晰的呢，谢谢指教。...

统一模版的话，应该没有问题，36度的退火温度太低了。。
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13楼2013-07-31 13:19:32
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1058744774

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-31 13:07:37
这好像不行。可能是你设计的引物太短了，一般情况下至少要有16-20个配对碱基才能保证引物的特异性。...

哦，这样呀，万分感谢！
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14楼2013-07-31 15:12:00
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hao327791557

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉模板应该没有问题，你的引物设计的不好吧，有好多二聚体的存在，建议你做PCR，用rTAP的或者LA的mix，这样能够排除加样等方面的原因。
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不懈
15楼2013-07-31 23:28:52
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笨熊zhou

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度或者延伸时间吧？
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每天对着镜子开心一笑
16楼2013-08-01 17:08:20
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度太低，提高退货温度。PCR条件和程序及片段大学写清楚，才好分析。
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17楼2013-08-02 09:05:25
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