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新虫 (初入文坛)

[求助] 急！各位帮忙看看，PCR后跑的琼脂糖凝胶电泳图，条带不清晰原因是什么？

各位大侠好，本人刚开始做PCR,帮忙分析一下电泳条带不清晰的原因吧。
图中从左到右是同一DNA模板，不同引物，同一RCR条件的产物
出现这种情况什么原因呢？说明模板有问题？还是需要改变PCR条件，或者增加镁离子浓度？
急！各位帮忙看看，PCR后跑的琼脂糖凝胶电泳图，条带不清晰原因是什么？
DNA.jpg
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1楼2013-07-30 22:50:44
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1058744774

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by rth1983 at 2013-07-31 03:21:28
你是在筛选引物吗？有的时候一些引物扩出来就这个样子，需要重新设计。不过如果你能确定这个引物扩增你的样品可以获得清晰的条带，可以优化一下PCR条件。镁离子浓度啥的到不用改，体系就用你们实验室的成熟的体系。 ...

我现在最想确定是不是模板的问题，如果是模板有问题那么第五个引物的条带为什么是清晰的呢，谢谢指教。
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6楼2013-07-31 09:42:30
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新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-30 23:20:50
是用gDNA为模板？引物的退火温度优化了没有？

是gDNA.退火温度是36℃，40个循环。优化退火温度是根据这个公式吗？Tm=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)
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7楼2013-07-31 09:51:46
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新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by qming82 at 2013-07-31 09:22:58
如果是自己设计的引物，需要事先做一个温度梯度PCR，找到最佳的退火温度，如果是从文献中参考的引物，一般就不用优化退火温度；如果是复杂模板，可以考虑在体系添加

请问添加什么？是不是用DNA模板跑电泳只出现一条亮带就能证明DNA纯度高？
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8楼2013-07-31 10:00:15
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新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-31 10:28:25
36°C是不是太低了？会有很多非特异条带的。通常PCR的退火温度在50-65°C。引物合成单上一般有Tm值，你根据Tm降低2-3°C试。如果有条件的话，最好能做个退火温度梯度。...

谢谢！我用的是北京鼎国昌盛合成的引物，引物合成单上有两个Tm值,分别是Tm1和Tm5，这两个值都在35℃-20℃之间；GC%为60%。
请问我的退火温度可以设到50℃吗？
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11楼2013-07-31 11:47:58
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新虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-31 13:07:37
这好像不行。可能是你设计的引物太短了，一般情况下至少要有16-20个配对碱基才能保证引物的特异性。...

哦，这样呀，万分感谢！
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14楼2013-07-31 15:12:00
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